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點(diǎn)擊次數(shù)：422 發(fā)布時(shí)間：2019/4/23
產(chǎn)品名稱:P1099/pCANTAB-5E噬菌體展示質(zhì)粒(非空載)
產(chǎn)品名稱:pCANTAB-5E噬菌體展示質(zhì)粒(非空載)
供應(yīng)商：上海遠(yuǎn)慕
質(zhì)粒大小:5216bp
質(zhì)粒標(biāo)簽:N-g3 signal，C-E tag
原核抗性:氨芐青霉素Amp
克隆菌株:大腸桿菌TG1
培養(yǎng)條件:37℃，有氧，LB
產(chǎn)品特點(diǎn)：是染色質(zhì)外的雙鏈共價(jià)閉合環(huán)形DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA），可自然形成超螺旋結(jié)構(gòu)，不同質(zhì)粒大小在2-300kb之間，<15kb的小質(zhì)粒比較容易分離純化，>15kb的大質(zhì)粒則不易提取。
本系統(tǒng)是用于抗體基因表達(dá)，制備重組抗體。宿主菌 TG1 為質(zhì)粒載體pCANTAB5e 復(fù)制和表達(dá)的宿主菌，無抗性，用 2×YT 培養(yǎng)基，37℃進(jìn)行培養(yǎng)。載體 pCANTAB5e 為用于構(gòu)建重組單鏈抗體 scFv 的載體，具有氨芐抗性，大小為4522bp，具體圖譜及酶切位點(diǎn)如下示。輔助噬菌體 M13K07 用于拯救噬菌粒，具有卡那抗性，在其輔助下噬菌粒得以復(fù)制，并以融合的形式表達(dá)在噬菌體表面。在 scFv 基因后面含有一段編碼 Tag 尾肽（E-Tag）的序列，在尾肽后面有一琥珀（Amber）終止密碼子，位于 scFv 基因與 cpIII 基因之間，在抑制型細(xì)菌 TG1 中，這種琥珀密碼子只有 20％有效，故在蛋白翻譯過程中可以通讀而形成 scFv-cpIII融合蛋白；但在非抑制型菌株中，如 HB2151，此終止子被識別，同時(shí) scFv 基因在翻譯過程中在 cpIII 基因前終止，形成獨(dú)立的抗體蛋白，滯留于細(xì)胞膜間隙，并在長時(shí)間培養(yǎng)后泄漏在培養(yǎng)液中，形成可溶性表達(dá)。
【操作方法】本方法來源于網(wǎng)絡(luò)，本平臺未做實(shí)驗(yàn)證實(shí)，僅供參考。
1. 輔助噬菌體毒種制備
1) 將輔助噬菌體 M13K07 劃線于 2×YT 瓊脂平板上；
2) 制備 2×YT 半固體瓊脂（0.7％瓊脂）為上層瓊脂（Top Agar），冷卻至 50 ℃時(shí)，取 4 mL Top Agar 并加入 0.5 mL 過夜培養(yǎng)的新鮮 TG1 菌（OD660 達(dá) 0.8），充分混勻，沿著劃線濃度從低至高的方向，傾注 Top Agar；
3) 37℃培養(yǎng) 6-12 小時(shí)，用接種針挑取單個(gè)噬菌斑，接種于 30-200 mL 2×YT-K（kanamycin 70 μg/mL），37℃充分振蕩培養(yǎng) 10-14 小時(shí)；
4) 8000 rpm 離心 15 min，4 ℃；
5) 小心取上清，建議用 0.45μm 濾膜過濾后，分裝無菌小管，存放 4℃至少可用半年。
2．噬菌體毒種的滴定
1) 準(zhǔn)備不含任何抗生素的 2×YT 培養(yǎng)平板 5-6 個(gè)；
2) 用 2×YT 培養(yǎng)基配制 0.7%瓊脂平板，即為表層瓊脂（Top Agar），冷卻至 42℃并在 42℃恒溫保存；
3) 將上述噬菌體溶液用培養(yǎng)基做 10-6、10-7、10-8、10-9、10-10 稀釋；
4) 取過夜培養(yǎng)的 TG1 菌液（OD660=1 左右），分裝小試管，500μL /小試管，標(biāo)明10-6 至 10-10 稀釋度；
備注：宿主菌的制備請參照 TG1 菌株說明書進(jìn)行。
5) 加入以上步驟 3 中依次稀釋的噬菌體 100μL 到每個(gè)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)稀釋度的試管中，充分混勻，37℃輕柔振蕩反應(yīng) 30 min；
6) 加入 Top Agar 3 mL 至每個(gè)試管中，立即澆注事先準(zhǔn)備好的平皿，37℃培養(yǎng)過夜；
7) 計(jì)算平皿上的空斑數(shù)，乘于相應(yīng)稀釋倍數(shù)，一般濃度可達(dá) 1012pfu/mL。
【注意事項(xiàng)】
1．噬菌體毒種，在使用前應(yīng)按以上推薦的方法進(jìn)行濃度滴定；
2．噬菌體毒種存放在 4℃下即可，不可-20℃或更低溫度凍存；
P1099/pCANTAB-5E噬菌體展示質(zhì)粒(非空載) 質(zhì)粒分類:
1.根據(jù)質(zhì)粒能否通過細(xì)菌的接合作用，可分為接合性質(zhì)粒和非接合性質(zhì)粒。接合性質(zhì)粒帶有與接合傳遞有關(guān)的基因。非接合質(zhì)粒在一定條件下通過與其共存的接合質(zhì)粒的誘動(dòng)或轉(zhuǎn)導(dǎo)而傳遞。
2.根據(jù)質(zhì)粒的不相容性，可分為不相容性和相容性。不相容性指結(jié)構(gòu)相似、密切相關(guān)的質(zhì)粒不能穩(wěn)定地共存于同一宿主細(xì)菌內(nèi)的現(xiàn)象，反之為相容性。常用于流行病學(xué)的調(diào)查。
3.根據(jù)質(zhì)粒在細(xì)菌內(nèi)的復(fù)制類型可分為兩類：嚴(yán)緊控制型和松弛控制型。嚴(yán)緊控制復(fù)制型質(zhì)粒的復(fù)制酶系與染色體DNA復(fù)制共用，只能在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制，當(dāng)細(xì)胞染色體停止復(fù)制時(shí)，質(zhì)粒也就不再復(fù)制。松弛控制復(fù)制型的質(zhì)粒的復(fù)制酶系不受染色體DNA復(fù)制酶系的影響，在整個(gè)細(xì)胞生長周期中隨時(shí)都可以復(fù)制，在染色體復(fù)制已經(jīng)停止時(shí)質(zhì)粒仍能繼續(xù)復(fù)制。
質(zhì)粒（plasmid）是細(xì)菌或細(xì)胞染色質(zhì)以外的，能自主復(fù)制的，與細(xì)菌或細(xì)胞共生的遺傳成，質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室操作而進(jìn)行人工構(gòu)建的質(zhì)粒。與天然質(zhì)粒相比，質(zhì)粒載體通常帶有一個(gè)或一個(gè)以上的選擇性標(biāo)記基因（如抗生素抗性基因）和一個(gè)人工合成的含有多個(gè)限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量盡可能減少，以便于基因工程操作。
產(chǎn)品特色優(yōu)勢：
1. 國內(nèi)對照品行業(yè)領(lǐng)導(dǎo)者，長達(dá)14年對照品的專業(yè)研發(fā)及標(biāo)準(zhǔn)制定
2. 高效穩(wěn)定的純化技術(shù)-高速逆流色譜技術(shù)的運(yùn)用
3. 特有的高速逆流色譜對照品研發(fā)中心及生產(chǎn)中心，保證對照品的質(zhì)量可控性及批量生產(chǎn)的穩(wěn)定性
4. 嚴(yán)格的質(zhì)量控制，通過全面的檢測（1HNMR 13CNMR MS HPLC）
5. 部分對照品已獲得國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局頒發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書
6. 完善的庫存及供應(yīng)體系，所有產(chǎn)品均能現(xiàn)貨供應(yīng)
7. 高效的銷售團(tuán)隊(duì)，99%的咨詢可即時(shí)回復(fù)
1、絕大部分產(chǎn)品備有現(xiàn)貨，一般情況下都能訂貨當(dāng)日發(fā)貨。
2、部分非常用產(chǎn)品，需提前1－2日預(yù)訂，海外期貨則需要提前3-6周預(yù)訂。
3、部分產(chǎn)品價(jià)格會因貨期、批次等因素發(fā)生變化，若有變動(dòng)以訂貨當(dāng)日價(jià)格為準(zhǔn)。
4、每日訂單截止時(shí)間為16點(diǎn)整，部分城市可到17點(diǎn)整，因超過截止時(shí)間造成當(dāng)日不能發(fā)貨的將于次日安排發(fā)貨。
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原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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