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【PCR檢測(cè)】病原微生物檢測(cè)操作方法
閱讀次數(shù)：239 發(fā)布時(shí)間：2024/12/11 10:25:07
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多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是一種模擬天然DNA復(fù)制過(guò)程，在體外擴(kuò)增特異性DNA（或RNA）片段的新技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)是將待檢雙鏈DNA經(jīng)94℃高溫變性成單鏈作模板，然后加入一對(duì)人工合成的寡核苷酸引物，引物分別與待擴(kuò)增DNA片段的兩端互補(bǔ)，經(jīng)55℃低溫退火，引物與模板互補(bǔ)結(jié)合。在72℃條件下，結(jié)合于模板上的引物在DNA聚合酶的催化下，利用反應(yīng)體系中的4種dNTP為原料，按堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式延伸合成兩條新的DNA鏈。經(jīng)過(guò)20-30個(gè)周期后，特異的目的DNA可擴(kuò)增百萬(wàn)倍以上。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后即可觀察到特異的擴(kuò)增條帶。
 
PCR方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，可檢測(cè)出少至0.1pg的目的DNA。目已廣泛應(yīng)用于多種病原微生物及寄生蟲(chóng)的檢測(cè)。
 
【材料】
 
1．無(wú)菌雙蒸水、石蠟油、溴化乙錠
 
2．10×PCR反應(yīng)緩沖液
 
3．25mmol dNTP混合液
 
4．引物1，引物2各50pmol／u1
 
5．模板DNA
 
6．5U／ul Taq DNA聚合酶
 
【儀器】
 
1．PCR擴(kuò)增儀
 
2．電泳儀
 
3．紫外線分析儀
 
【方法】
 
1．在0.5m1EP管中，加入以下成分：
 
10×PCR反應(yīng)緩沖液5u1
 
引物1 2ul
 
引物1 2ul
 
模板DNA 10u1
 
dNTP混合液4ul
 
Taq DNA聚合酶1ul
 
無(wú)菌雙蒸水加至50ul
 
混勻,加50 ul石蠟油，防止樣品水分蒸發(fā)。
 
2．將反應(yīng)管置于PCR儀中，94℃變性4min。然后按94℃變性30s→55℃退火30s→72℃延伸1min，循環(huán)35次后，72℃延伸10 min。
 
3．反應(yīng)完成后，取l0ul PCR擴(kuò)增液，加至2％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電壓100V，電泳30~60min后，置紫外線分析儀下觀查擴(kuò)增結(jié)果。
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