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　　病毒一直是基因轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中的一大利器，尤其 慢病毒 更是實(shí)驗(yàn)室的�？汀Ｈ欢�，慢病毒的存儲(chǔ)不當(dāng)或用量不合適，可能會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低，細(xì)胞狀態(tài)差等情況。

慢病毒感染效率低，主要需要考慮的問(wèn)題有

1、細(xì)胞是否適合用慢病毒進(jìn)行感染？（慢病毒適用于大部分細(xì)胞系，例如肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等，但也有一些細(xì)胞不適合用慢病毒感染，可能更適合用腺病毒，可查閱文獻(xiàn)，或咨詢(xún)上海遠(yuǎn)慕生物）

2、慢病毒是否進(jìn)行了正確的存儲(chǔ)和稀釋?zhuān)浚ㄈ绻�病毒存�?chǔ)不當(dāng)或反復(fù)凍融會(huì)降低病毒滴度/活性）

3、感染操作問(wèn)題（MOI是否合適，感染方法，感染及觀察時(shí)間是否合適）

4、對(duì)于一些難感染細(xì)胞的感染方法：例如懸浮細(xì)胞可使用平角離心轉(zhuǎn)染法，其他一些較難感染的細(xì)胞可進(jìn)行二次感染。

5、可以添加助轉(zhuǎn)染試劑polybrene增加感染效率

慢病毒的安全和存儲(chǔ)

慢病毒相關(guān)實(shí)驗(yàn)需要在生物安全柜（BL-2別）內(nèi)進(jìn)行操作，如果不小心濺出也不要驚慌，立即用70%乙醇加 1%的SDS溶液擦拭干凈即可。接觸過(guò)病毒的槍頭，離心管，培養(yǎng)板等要用84消毒液浸泡后統(tǒng)一處理。病毒相關(guān)的廢棄物也需要特殊收集再統(tǒng)一經(jīng)高溫滅菌處理哦。

慢病毒是存儲(chǔ)在-80℃的，如果您在收到慢病毒的一周內(nèi)就會(huì)使用，也可放在4°C保存，避免反復(fù)凍融，有必要可以行分裝。

摸索病毒感染的MOI

MOI（Multiplicity of Infection，感染復(fù)數(shù)）是指每個(gè)細(xì)胞感染的病毒數(shù)，通常MOI越高，病毒整合到染色體的數(shù)量以及目的蛋白的表達(dá)量越高。

用96孔板摸索梯度值：

實(shí)驗(yàn)一天，以每毫升3~5X10^6個(gè)目的細(xì)胞接種96孔培養(yǎng)板中的12個(gè)孔，

體積為90 µl。感染預(yù)實(shí)驗(yàn)共分為四組，每組三個(gè)不同梯度的MOI。

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，配備1X10^8TU/ml、1X10^7TU/ml、1X10^6TU/ml病毒液。

將10 µl三個(gè)不同梯度的病毒加到各組的相應(yīng)孔中。加入的病毒量分別為1X10^6TU，1X10^5 TU，1X10^4 TU，而細(xì)胞經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)，此時(shí)細(xì)胞的數(shù)目大約為1 X10^4個(gè)，所以三個(gè)孔的MOI分別為100、10、1

感染3-4天后，觀察熒光表達(dá)情況，通過(guò)細(xì)胞感染效果，確認(rèn)目的細(xì)胞的感染條件和感染參數(shù)。

每孔加病毒量（µl）=MOI*細(xì)胞數(shù)/滴度（ＴＵ／ｍｌ）×１０００

確定了細(xì)胞的MOI值，下面就要開(kāi)始進(jìn)行細(xì)胞的感染

推薦１／２小體積感染法，即在正常培養(yǎng)液的一半量的情況下加入慢病毒，感染４ｈ后補(bǔ)足培養(yǎng)液至正常體積，感染２４ｈ后換液。對(duì)于適用Polybrene的細(xì)胞，也可適量加入來(lái)提升感染效率，它常用的工作濃度為6~8µg/ml。

感染后４８ｈ，對(duì)于帶ＧＦＰ報(bào)告基因的病毒，可通過(guò)熒光顯微鏡觀測(cè)GFP表達(dá)效率，如果要篩選穩(wěn)定攜帶Puromycin抗性基因的病毒，則需換上含適當(dāng)濃度Puromycin的新鮮完全培養(yǎng)液。

注：不同實(shí)驗(yàn)室由于細(xì)胞的來(lái)源、代數(shù)和細(xì)胞狀態(tài)等因素的影響，MOI值也略有差異，以下數(shù)據(jù)是在細(xì)胞感染效率在85-100%細(xì)胞狀態(tài)良好的情況下獲得的，僅供參考。

對(duì)于一些特殊的細(xì)胞在感染時(shí)還要注意以下事項(xiàng)

◆懸浮細(xì)胞：感染懸浮或半懸浮細(xì)胞，要通過(guò)平角離心轉(zhuǎn)染法，低速（200´g）離心1 h，然后放入培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)即可。若由于實(shí)驗(yàn)條件有限，沒(méi)有平角離心機(jī)，可用離心管代替。

◆難感染的細(xì)胞：對(duì)于難感染的細(xì)胞，如DC（樹(shù)突狀細(xì)胞）等，可采用多次感染的方法，即感染24 h后，更換新鮮病毒進(jìn)行二次感染，可顯著提升感染效率。

◆傳代能力較差的原代細(xì)胞：對(duì)于一些傳代能力較差的原代細(xì)胞，比如BMSC等，建議采用滴度更高的腺病毒進(jìn)行感染。