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實(shí)驗(yàn)概要

本實(shí)驗(yàn)介紹了根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞的制備及凍融法轉(zhuǎn)化。

主要試劑

利福平，LB培養(yǎng)基，NaCl，CaCl2，YEP培養(yǎng)基，卡那霉素

主要設(shè)備

搖床，高速離心機(jī)，低溫冰箱，水浴鍋

實(shí)驗(yàn)材料

根癌農(nóng)桿菌GV3101單菌落

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞的制備

1) 挑取單菌落GV3101，接種于5mL附加有50mg/L的利福平的液體LB培養(yǎng)基中，28℃，200rpm，過夜；

2) 取2mL培養(yǎng)物至50mL液體LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.5左右；

3) 將培養(yǎng)物冰浴30min，4℃，5000rpm，離心5min，棄上清；

4) 用l0mL 0.lmol/L冷的NaCl懸浮菌體；

5) 4℃，5000rpm，離心5min，棄上清；

6) 1 mL 20mmo1/L冷的CaCl2懸浮，分裝成50uL/管，液氮速凍后，-80℃保存。

2. 凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

1) 冰浴融化農(nóng)桿菌LBA4404/GV3101感受態(tài)細(xì)胞；

2) 加入3ul表達(dá)載體質(zhì)粒，冰浴30min，液氮中凍1 min，然后在37℃水浴5min；

3) 加入950uL無抗生素的YEP培養(yǎng)基，28℃，200rpm，振蕩培養(yǎng)4h；

4) 1 0000rpm離心1 min以濃縮菌液，用100uL YEP回溶菌體；

5) 將回溶后的菌體涂于附加50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的固體YEP培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)36-48h。菌液PCR檢測陽性克隆。