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關(guān)于RNA提取時RNA降解的原因
閱讀次數(shù):571 發(fā)布時間:2022/10/31 13:38:19
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  關(guān)于RNA提取時RNA降解的原因

1 ) 新鮮細胞:

裂解液的量不足,使得裂解不充分。

2 ) 新鮮組織:

某些含有內(nèi)源性核酸酶的樣品,很難避免RNA酶的降解,建議采用的方法為在液氮條件下將組織研碎,并且,勻漿時采用更多的裂解液。

3 ) 冷凍樣品:

樣品取材后應(yīng)該迅速置于液氮中冷凍存放,然后轉(zhuǎn)移到-70℃冰箱存放。如果未經(jīng)液氮速冷直接轉(zhuǎn)移到-70℃冰箱存放,會造成RNA緩慢降解。樣品研磨后,在液氮剛剛揮發(fā)完時,將樣品迅速轉(zhuǎn)移到含裂解液的容器中,立即混勻勻漿。

4 ) 外源 RNA 酶的污染:

試劑、器械等實驗用品應(yīng)該采用DEPC 水滅菌處理。

5 ) 內(nèi)源 RNA 酶的污染:

抑制劑失效或者用量不夠,實驗樣品過多或者勻漿溫度過高。

RNA提取得率偏低原因分析

1 ) 組織或細胞中 RNA 含量偏低:

不同細胞或者組織中RNA的豐度不一樣,RNA提取量也不一致。

2 ) 樣品起始量太少或者太多:

樣品起始量太少,則細胞組織中RNA含量較低,樣品過多則超過裂解液的裂解能力,使得裂解不完全,從而RNA得率低。

如何從凍存的細胞提取RNA

1). 將凍存管從液氮或冰箱中取出;

2). 不待細胞溶解,將Trizol500ul-1ml直接放入凍存管中,此時Trizol會凍成冰狀;

3). 將凍存管緩慢融化,并用加樣器吹打混勻;

4). 將細胞裂解液移至Eppendorf管中,16000′g離心1min,吸出管底絮狀沉淀;

注釋:該步驟并非必要,多數(shù)Protocol省略該步驟,但加入該步中能明顯提高RNA的質(zhì)量;注意不能離心時間過長,否則沉淀難以吸出,將200ul黃槍頭尖部切去0.5cm操作;

5). 加入1/5體積的氯仿(約200ul),上下顛倒2~3min;

6). 4℃ 16000′g離心15min,輕輕吸出上清至新的Eppendorf管(約700ul ),不要擾動中間層或用手指使Eppendorf管變溫;

注釋:一般情況下提取的RNA已經(jīng)足夠,而且在逆轉(zhuǎn)錄過程中RNA的質(zhì)量要遠較RNA的數(shù)量更重要,一般僅取上清的上1/2左右足矣,這樣可大限度避免對于中間蛋白相的擾動;

7). 加入等體積異丙醇(約800ul),充分混勻,冰上靜置15min;

8). 4℃ 16000′g離心15min,輕輕倒掉上清,僅留管底沉淀;

9). 加入1ml預(yù)冷的無水乙醇,4℃ 16000′g離心2min,輕輕倒掉上清,僅留管底沉淀;

10). 倒置Eppendorf管于干凈濾紙上,至可見乙醇完全揮發(fā);

11). 用100ul 新鮮制備的DEPC處理過的MilliQ 水溶解RNA,如果溶解不好,-20℃反復凍融1~2次,4℃ 16000′g離心3min,將上清吸至新的Eppendorf管中;

12). 加入等體積12 M LiCl,-20℃靜置15min;

13). 4℃ 16000′g離心15min,輕輕倒掉上清,僅留管底沉淀;

注釋:該步驟的目的在于去除小分子降解RNA和鹽分;但可以省略;只有大分子RNA在高濃度LiCl中沉淀,DNA不會沉淀;

14). 加入1ml預(yù)冷的無水乙醇,4℃ 16000′g離心2min,輕輕倒掉上清,僅留管底沉淀;

注釋:該步的目的在于去除LiCl,LiCl溶于乙醇,而RNA不溶于乙醇,利用溶解度分離;

15). 倒置Eppendorf管于干凈濾紙上,至可見乙醇完全揮發(fā)RNA邊緣呈半透明;

16). 用40ul新鮮制備的DEPC處理過的MilliQ 水溶解RNA;

17). 取出5ul 用于紫外分光光度計測定和瓊脂糖凝膠電泳,其余凍存-70℃。

注釋:如果OD260/OD280<1.8,則加入等體積Trizol,按上述步驟重新提純。
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