關(guān)于RNA提取時RNA降解的原因
1 ) 新鮮細胞：
裂解液的量不足，使得裂解不充分。
2 ) 新鮮組織：
某些含有內(nèi)源性核酸酶的樣品，很難避免RNA酶的降解，建議采用的方法為在液氮條件下將組織研碎，并且，勻漿時采用更多的裂解液。
3 ) 冷凍樣品：
樣品取材后應(yīng)該迅速置于液氮中冷凍存放，然后轉(zhuǎn)移到-70℃冰箱存放。如果未經(jīng)液氮速冷直接轉(zhuǎn)移到-70℃冰箱存放，會造成RNA緩慢降解。樣品研磨后，在液氮剛剛揮發(fā)完時，將樣品迅速轉(zhuǎn)移到含裂解液的容器中，立即混勻勻漿。
4 ) 外源 RNA 酶的污染：
試劑、器械等實驗用品應(yīng)該采用DEPC 水滅菌處理。
5 ) 內(nèi)源 RNA 酶的污染：
抑制劑失效或者用量不夠，實驗樣品過多或者勻漿溫度過高。
RNA提取得率偏低原因分析
1 ) 組織或細胞中 RNA 含量偏低：
不同細胞或者組織中RNA的豐度不一樣，RNA提取量也不一致。
2 ) 樣品起始量太少或者太多：
樣品起始量太少，則細胞組織中RNA含量較低，樣品過多則超過裂解液的裂解能力，使得裂解不完全，從而RNA得率低。
如何從凍存的細胞提取RNA
1). 將凍存管從液氮或冰箱中取出；
2). 不待細胞溶解，將Trizol500ul-1ml直接放入凍存管中，此時Trizol會凍成冰狀；
3). 將凍存管緩慢融化，并用加樣器吹打混勻；
4). 將細胞裂解液移至Eppendorf管中，16000′g離心1min，吸出管底絮狀沉淀;
注釋：該步驟并非必要，多數(shù)Protocol省略該步驟，但加入該步中能明顯提高RNA的質(zhì)量；注意不能離心時間過長，否則沉淀難以吸出，將200ul黃槍頭尖部切去0.5cm操作；
5). 加入1/5體積的氯仿（約200ul）,上下顛倒2~3min；
6). 4℃ 16000′g離心15min，輕輕吸出上清至新的Eppendorf管（約700ul ），不要擾動中間層或用手指使Eppendorf管變溫；
注釋：一般情況下提取的RNA已經(jīng)足夠，而且在逆轉(zhuǎn)錄過程中RNA的質(zhì)量要遠較RNA的數(shù)量更重要，一般僅取上清的上1/2左右足矣，這樣可大限度避免對于中間
蛋白相的擾動；
7). 加入等體積異丙醇（約800ul）,充分混勻，冰上靜置15min；
8). 4℃ 16000′g離心15min，輕輕倒掉上清，僅留管底沉淀；
9). 加入1ml預(yù)冷的無水乙醇，4℃ 16000′g離心2min，輕輕倒掉上清，僅留管底沉淀；
10). 倒置Eppendorf管于干凈濾紙上，至可見乙醇完全揮發(fā)；
11). 用100ul 新鮮制備的DEPC處理過的MilliQ 水溶解RNA，如果溶解不好，-20℃反復凍融1~2次，4℃ 16000′g離心3min，將上清吸至新的Eppendorf管中；
12). 加入等體積12 M LiCl，-20℃靜置15min；
13). 4℃ 16000′g離心15min，輕輕倒掉上清，僅留管底沉淀；
注釋：該步驟的目的在于去除小分子降解RNA和鹽分；但可以省略；只有大分子RNA在高濃度LiCl中沉淀，DNA不會沉淀；
14). 加入1ml預(yù)冷的無水乙醇，4℃ 16000′g離心2min，輕輕倒掉上清，僅留管底沉淀；
注釋：該步的目的在于去除LiCl，LiCl溶于乙醇，而RNA不溶于乙醇，利用溶解度分離；
15). 倒置Eppendorf管于干凈濾紙上，至可見乙醇完全揮發(fā)RNA邊緣呈半透明；
16). 用40ul新鮮制備的DEPC處理過的MilliQ 水溶解RNA；
17). 取出5ul 用于紫外分光光度計測定和瓊脂糖凝膠電泳，其余凍存-70℃。
注釋：如果OD260/OD280＜1.8，則加入等體積Trizol，按上述步驟重新提純。
客服一
