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1. 凝膠的選擇
根據(jù)層析物質(zhì)分子量的大小選擇不同型號的凝膠，如除鹽和除游離的熒光素，則可選用粗、中粒度的G25或G50，G250多用于分離蛋白質(zhì)單體，G200多用于分離蛋白質(zhì)凝膠聚合體等。

2. 凝膠的預(yù)處理
稱取適量的凝膠加入過量的緩沖液在冰箱（或室溫）中充分膨脹，或在沸水中煮，膨脹時間應(yīng)根據(jù)不同型號的凝膠而定。
凝膠量與型號和層析柱大小與規(guī)格及凝膠用量

層析柱規(guī)格 凝膠的規(guī)格和用量（g） 
直徑（cm） 高（cm） 容量（ml） G25 G50 G100 G200
0.9 15 9.5 2.5 1 0.6 0.3
0.9 30 19 5 2 1.2 0.6
0.9 60 38 10 4 2.5 1.2
1.6 20 40 10 4 2.5 1.2
1.6 40 80 20 8 5.0 2.4
1.6 70 140 35 14 9.0 4.4
1.6 100 200 50 20 12.5 6
2.6 40 210 50 20 12 7
2.6 70 370 90 35 20 12
2.6 100 530 130 50 30 17
2.6 60 1000 250 110 70 35
為使粒子均勻一致需進(jìn)行浮選，即加入凝膠粒子后，輕輕攪拌，靜置20min，傾去沉淀的粒子，如此反復(fù)數(shù)次即可。

3. 裝柱
層析柱的選擇一般根據(jù)分離樣品的種類和樣品的數(shù)量而定。純化蛋白質(zhì)時，柱床體積應(yīng)為樣品體積的25～100倍。去鹽、游離熒光素約為樣品體積的4～10 倍。柱太短，影響分離效果。柱長一些，分離效果好，但柱太長，則延長分離時間，樣品也稀釋過度。層析柱的內(nèi)徑也要選擇適當(dāng)。內(nèi)徑過細(xì)，會發(fā)生“器壁效應(yīng)”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果。所以層析柱的內(nèi)徑和高度應(yīng)有一定的比例。對于除鹽來說應(yīng)為1:5～1:25；對于純化蛋白質(zhì)來說應(yīng)為1:20～1:100。

4. 加樣與洗脫
樣品體積不宜過多，好為床體積的1％～5%，多不要超過10%。樣品濃度也不宜過大，濃度過大粘度大，分離效果差，一般不超過4%。
洗脫液應(yīng)與膨脹一致，否則更換溶劑，凝膠體積會發(fā)生變化，影響分離效果。洗脫液要有一定的離子強度和pH值。分離血清蛋白常用 0.02～0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl緩沖鹽溶液（0.14Mol/L NaCl）。

5. 洗脫液收集
利用自動分步收集器收集，并以20%磺基水楊酸測試，當(dāng)?shù)鞍滓合聛頃r，開始分管收集，至無蛋白液為止。

6. 凝膠柱的重復(fù)使用與保存
當(dāng)樣品的各組分全部洗脫下來之后，即可加入新的樣品，繼續(xù)使用。保存方法有三種：
（1） 在液相中保存方便，即于凝膠懸液中加入防腐劑（如0.002%洗必泰）或高壓滅菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。
（2） 用完后，以水沖洗，然后用60%~70%酒精液沖洗，凝膠體積縮小，即在半收縮狀態(tài)下保存。
（3） 長期不用者，好以干燥狀態(tài)保存，即水洗凈后，用含乙醇的水洗，逐漸加大乙醇用量，后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽濾干，于 60℃~80℃干燥后保存。加乙醇時，切忌一上來就用濃乙醇處理，以防結(jié)塊。