核酸檢測流程你知道嗎
閱讀次數(shù)：468 發(fā)布時間：2022/3/3 11:22:05
HIV核酸定性檢測技術(shù)，其檢測過程分為核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA、PCR擴增反應(yīng)、擴增產(chǎn)物定性分和結(jié)果判定和完成報告單。
實驗室檢測具體步驟如下：
1. 核酸提取
使用硅膠柱離心、磁性硅膠顆粒分離方法以及自動化儀器等商品化試劑或設(shè)備并按說明書操作。提取RNA時應(yīng)注意防止RNA降解。DNA應(yīng)置于-20℃保存，RNA和需長期保存的DNA應(yīng)置于-80℃保存。
2. 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA
逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成反應(yīng)需使用逆轉(zhuǎn)錄引物、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液和適量無RNA/DNA酶的超純水以及RNA模板。在擴增儀或水浴箱中，在規(guī)定的溫度和時間下進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。建議使用商品化RT-PCR一步法試劑進行輪擴增反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成反應(yīng)需使用逆轉(zhuǎn)錄引物、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液和適量無RNA/DNA酶的超純水以及RNA模板。在擴增儀或水浴箱中，在規(guī)定的溫度和時間下進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用商品化RT-PCR一步法試劑進行輪擴增反應(yīng)。
3. PCR擴增反應(yīng)（使用二次擴增的套式PCR擴增方法）
PCR反應(yīng)需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶（如Taq酶等）、緩沖液、和適量無RNA/DNA酶超純水、以及模板（DNA或cDNA）。在擴增儀中，按照設(shè)定的程序進行擴增。使用二次擴增的套式PCR擴增方法。
4. 擴增產(chǎn)物定性分析
擴增產(chǎn)物常用分析方法是瓊脂糖凝膠電泳法，與分子量標準比較，判斷擴增片段是否在預(yù)期的分子量范圍內(nèi)。其它擴增產(chǎn)物分析方法還有限制性內(nèi)切酶酶切分析、特異性探針雜交分析以及DNA序列分析等。自動化核酸擴增儀使用酶聯(lián)比色分析或熒光探針雜交等原理測定。
5.結(jié)果判定和完成報告單
（1）實驗成立的條件：每一次檢測需同時做兩個陽性對照、兩個陰性對照，只有陽性對照擴增出預(yù)期的片段、陰性對照沒有擴增出任何片段、雙份平行樣品結(jié)果一致的情況下實驗才成立，可以作出核酸陽性或陰性反應(yīng)結(jié)果的判定。
（2）HIV核酸檢測陽性：發(fā)現(xiàn)核酸陽性反應(yīng)，應(yīng)該重復(fù)采集樣品進行復(fù)測，復(fù)測結(jié)果呈核酸陽性反應(yīng)則判定為核酸陽性，復(fù)測結(jié)果為核酸陰性反應(yīng)則判為不確定結(jié)果，需進一步隨訪檢測。
（3）HIV核酸檢測陰性：只可報告本次實驗結(jié)果陰性。
（4）應(yīng)在完成檢測后5個工作日內(nèi)發(fā)出檢測報告。
客服一
