1) Acr及Bis的純度：應(yīng)選用分析純的Acr及Bis，如試劑不純，含有雜質(zhì)或丙烯酸時(shí)，則凝膠聚合不均一，或聚合時(shí)間延長(zhǎng)甚至不聚合， 因而需進(jìn)一步純化。 Acr和Bis貯液的pH值為4.9-5.2，當(dāng)pH值的改變大于0.4pH單位則不能使用，因在偏酸或偏堿的環(huán)境中，它們可不斷水解放出丙烯酸和NH4+ 而引起pH值改變，從而影響凝膠聚合。 因此，配制的Acr和Bis貯液應(yīng)置棕色瓶中，4℃貯存 ，存放期一般不超過(guò)1-2個(gè)月為宜。
2) AP、核黃素、TEMED：增加AP和TEMED可加快聚合速率，但過(guò)量的AP和TEMED會(huì)引起電泳時(shí)燒膠和譜帶變形。應(yīng)選擇合適的配方使聚合在40-60min內(nèi)完成。
3) pH：堿性條件下聚合快，但堿性過(guò)強(qiáng)時(shí)膠硬而脆，需高pH時(shí)應(yīng)減少AP和TEMED用量，制酸性膠可加AgNO3等促進(jìn)聚合。
4) 溫度：溫度高聚合快，但高濃度凝膠聚合時(shí)易產(chǎn)生小氣泡，低溫(5℃)聚合凝膠會(huì)變得脆而混濁，一般25-35℃聚合較好。
5) 氧分子：氧分子阻礙凝膠聚合，故不含SDS的凝膠更好先抽真空脫氣，再加引發(fā)劑。
聚丙烯酰胺凝膠電泳
PAGE應(yīng)用范圍廣，可用于
蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等。 聚丙烯酰胺凝膠電泳又有以下幾種：
非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳
變性聚丙烯酰胺凝膠電泳
連續(xù)密度梯度電泳
聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳
聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳
聚丙烯酰胺凝膠電泳 (DNA序列分析)
1 儀器： PCR擴(kuò)增儀(96孔)、序列分析電泳槽：DYCZ-20CDYCZ-20G、高壓電源：DYY-10C或DYY-12型 水平搖床(WD-9405D)、電子天平 (精確1毫克) 、移液槍：WD-2108 、雙顯磁力攪拌器、高壓蒸汽滅菌鍋、pH計(jì)、水浴鍋、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、微型離心機(jī)：WD-2105A/B等
2 實(shí)驗(yàn)試劑： 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)、Tris堿、10×Buffer、 dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、去離子甲酰胺、溴酚藍(lán) 、 二甲苯青FF、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、硼酸、尿素、 親和硅烷、剝離硅烷、四甲基乙二胺、過(guò)硫酸銨、硝酸銀 、DNA Marker(根據(jù)PCR片段大小選擇合適的Marker范圍， 如SSR實(shí)驗(yàn)的范圍在100bp—400bp之間)
聚丙烯酰胺凝膠分為非變性凝膠和變性凝膠 所謂非變性凝膠，即在凝膠中不加SDS和巰基乙醇等變性劑，這種凝膠中，蛋白質(zhì)仍保持活性，其遷移率受它的靜電荷與分子大小兩個(gè)因素的影響。因此在非變性凝膠中進(jìn)行電泳是不能測(cè)得分子量的，常用于酶的鑒定、同工酶分析和提純。 所謂變性凝膠，即在凝膠中加入變性劑，如尿素、SDS(十二烷基磺酸鈉)、巰基乙醇、DTT等。這些變性劑可以破壞或改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，把絕大部分蛋白質(zhì)分離成組成它們的亞基。同時(shí)在蛋白質(zhì)分子周圍包圍了大量負(fù)電荷。這種電荷基本上掩蓋了無(wú)變性劑存在時(shí)正常就有的任何電荷。蛋白質(zhì)在這種變性凝膠中的遷移率與它們分子量的對(duì)數(shù)成直線關(guān)系。因此利用變性凝膠進(jìn)行電泳可以測(cè)得蛋白質(zhì)的分子量。目應(yīng)用較多的變性劑為SDS。
客服一
