載體主要有病毒和非病毒兩大類,其中質(zhì)粒DNA是一種新的非病毒轉(zhuǎn)基因載體。這里主要介紹下一個合格質(zhì)粒的組成要素、載體的一些基本知識以及如何閱讀質(zhì)粒圖譜。
一、一個合格質(zhì)粒 的組成要素復(fù)制起始位點Ori 即控制復(fù)制起始的位點。原核生物DNA 分子中只有一個復(fù)制起始點。而真核生物DNA分子有多個復(fù)制起始位點。
抗生素抗性基因 可以便于加以檢測，如Amp+ ,Kan+多克隆位點MCS 克隆攜帶外源基因片段P/E 啟動子/增強子Terms 終止信號加poly(A)信號 可以起到穩(wěn)定mRNA作用。
二、如何閱讀質(zhì)粒圖譜步：先看Ori的位置，了解質(zhì)粒的類型(原核/真核/穿梭質(zhì)粒)
第二步：再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記。
(1)Ampr 水解β-內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。
(2)tetr 可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。
(3)camr 生成氯霉素羥乙�；苌铮怪ザ拘�。
(4)neor(kanr)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 使G418(長那霉素衍生物)失活
(5)hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位點(MCS)。它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。
第五步：是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動子-核糖體結(jié)合位點-克隆位點-轉(zhuǎn)錄終止信號。這是用來區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體。克隆載體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。選用那種載體，還是要以實驗?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。
啟動子-核糖體結(jié)合位點-克隆位點-轉(zhuǎn)錄終止信號
啟動子-促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)錄的DNA順序，這個DNA區(qū)域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是DNA分子上可以與RNApol特異性結(jié)合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位，但啟動子本身不被轉(zhuǎn)錄。
增強子/沉默子-為真核基因組(包括真核病毒基因組)中的一種具有增強鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子-負(fù)增強子，負(fù)調(diào)控序列。
核糖體結(jié)合位點/起始密碼/SD序列(Rbs/AGU/SDs)：mRNA有核糖體的兩個結(jié)合位點，對于原核而言是AUG(起始密碼)和SD序列。
轉(zhuǎn)錄終止順序(終止子)/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，此位點down-stream有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成poly(A)加尾信號。結(jié)構(gòu)基因的后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，此位點down-stream有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成poly(A)加尾信號。
回答有人之提出的一個問題：為什么質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時針有的箭頭逆時針，那其實是代表兩條DNA鏈，即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上.
三、介紹一下關(guān)于載體的知識1.什么是載體
即要把一個有用的基因(目的基因——研究或應(yīng)用基因)通過基因工程手段送到生物細(xì)胞(受體細(xì)胞)，需要運載工具(交通工具)攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，這種運載工具就叫做載體(vector)。P.S.基因工程所用的vector實際上是DNA分子，是用來攜帶目的基因片段進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA。
2.載體的分類
按功能分成：(1)克隆載體 都有一個松弛的復(fù)制子，能帶動外源基因，在宿主細(xì)胞中復(fù)制擴增。它是用來克隆和擴增DNA片段(基因)的載體。(所以有時實驗時擴增效率低下，要注意是不是使用的嚴(yán)謹(jǐn)行載體)
(2)表達(dá)載體 具有克隆載體的基本元件(ori,Ampr,Mcs等)還具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序的載體。
按進(jìn)入受體細(xì)胞類型分：(1)原核載體 (2)真核載體 (3)穿梭載體(sbuttle vector)指在兩種宿主生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子，因而可以運載目的基因(穿梭往返兩種生物之間).
P.S.穿梭質(zhì)粒含原核和真核生物2個復(fù)制子，以確保兩類細(xì)胞中都能擴增。
3.基因工程載體的3個特點：
(一)都能獨立自主的復(fù)制：載體DNA分子中有一段不影響它們擴增的非必需區(qū)域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被動的跟著載體一起復(fù)制/擴增，就像載體的正常成分一樣。
(二)都能便利的加以檢測： 如載體的藥物抗性基因，多是抗生素抗性基因，將受體細(xì)胞放在含有該抗生素培養(yǎng)板上培養(yǎng)生長時，只有攜帶這些抗性基因的載體分子的受體細(xì)胞才能存活。
(三)都能容易進(jìn)入宿主細(xì)胞中去，也易從宿主細(xì)胞中分離純化出來。
4.載體的選擇和制備：選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點。如果構(gòu)建的目的是要表達(dá)一個特定的基因，則要選擇合適的表達(dá)載體。
載體選擇主要考慮下述3點：
【1】構(gòu)建DNA重組體的目的，克隆擴增/表達(dá)表達(dá)，選擇合適的克隆載體/表達(dá)載體。
【2】.載體的類型：
(1)克隆載體的克隆能力-據(jù)克隆片段大小(大選大，小選小)。如<10kb選質(zhì)粒。
(2)表達(dá)載體據(jù)受體細(xì)胞類型-原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體。
(3)對原核表達(dá)載體應(yīng)該注意3點：
①選擇合適的啟動子及相應(yīng)的受體菌;
②用于表達(dá)真核
蛋白質(zhì)時注意克服4個困難和閱讀框錯位;
③表達(dá)天然蛋白質(zhì)或融合蛋白作為相應(yīng)載體的參考。
【3】載體MCS中的酶切位點數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應(yīng)目的基因與載體易于鏈接，不產(chǎn)生閱讀框架錯位。
選用質(zhì)粒(常用)做載體的4點要求：
①選分子量小的質(zhì)粒，即小載體(1-1.5kb)→不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多(也有大載體);
②一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴增不受約束，一般10個以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒<10個。
③必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地;
④必需有易檢測的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr(試一試)。
客服一
