相信如何提高目的重組
蛋白的誘導(dǎo)表達量是很多同學(xué)在研究中都會遇到的問題。泡了無數(shù)論壇，看了無數(shù)帖子，嘗試過IPTG的誘導(dǎo)濃度、培養(yǎng)基成分、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間，甚至讓別的公司幫忙做密碼子優(yōu)化（將目的片段通過全基因合成的方式合成出來）。總的來說，提高IPTG濃度是可以提高目的蛋白的誘導(dǎo)表達量的，但一般也就用到1mM的濃度，再高對細(xì)胞有毒性； 培養(yǎng)基營養(yǎng)越豐富，表達量越高，所以如果追求表達量的話，就不要用LB培養(yǎng)基了，用自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基吧； 誘導(dǎo)溫度，溫度越低表達量越低，但是可溶的比例一般來說會越高，所以如果追求表達量可以嘗試37℃或者42℃（沒試過42℃）；誘導(dǎo)時間，這個跟培養(yǎng)基成分及供氧情況很有關(guān)系，如果供氧不足/營養(yǎng)不夠，提高時間會起到反效果。
綜合而言，一般用的重組蛋白誘導(dǎo)表達條件是固定的，有時候要追求可溶表達，頂多就調(diào)整下誘導(dǎo)溫度（25℃）。條件就是：自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基（不用額外的IPTG），37℃，20h。一般來說大分部蛋白的表達量都還可以。
但有些蛋白的表達量不行，或者某些蛋白需要長期大量使用，因此提高這些重組蛋白的誘導(dǎo)表達量就十分有必要了，如果進一步提高呢？
我們都知道，蛋白質(zhì)的表達量和蛋白質(zhì)的翻譯效率有關(guān)，翻譯效率又跟mRNA的二結(jié)構(gòu)又有關(guān)系，如果mRNA形成了復(fù)雜的二結(jié)構(gòu)，會導(dǎo)致核糖體無法順暢的將整個mRNA讀通，甚至?xí)釓膍RNA上掉下來。一般公司號稱的密碼子優(yōu)化，也就是通過替換掉一些稀有密碼子，顯然如果不從二結(jié)構(gòu)上考慮的話，是沒法提高蛋白質(zhì)的表達量的，而事實也確實如此。在公司做研發(fā)的幾年中，做過多個蛋白的密碼子優(yōu)化（通過全基因合成的方式），結(jié)果差強人意。
天介紹的方法，不是從二結(jié)構(gòu)上來預(yù)測的（據(jù)我所知，目沒有比較準(zhǔn)確的方法來預(yù)測mRNA的二姐結(jié)構(gòu)），而是一種簡單、高效的方法：通過優(yōu)化目的基因的5＇部分DNA序列，而且不需要通過軟件預(yù)測，完全隨機，包含所有可能（理論上），且不改變氨基酸序列。
原理：蛋白質(zhì)的翻譯效率很大程度上跟翻譯起始效率有關(guān)，因此mRNA的5＇端必須得很好翻譯，好不要有復(fù)雜的二結(jié)構(gòu)；通過PCR的方法在基因的5‘端引入簡并序列，構(gòu)建克隆，挑選多個克隆，誘導(dǎo)表達之，SDS-PAGE電泳檢測表達量的高低，挑選高表達克隆進行測序。
實驗步驟：
1.設(shè)計目的重組蛋白質(zhì)的N端10-15個氨基酸的簡并序列。
2.引物合成上述簡并序列，同時設(shè)計合成目的基因反向引物。
3.PCR擴展目的基因，這樣在目的基因的5‘端就引入了兼并序列，同時不改變氨基酸序列。
4.雙酶切，插入到目標(biāo)載體。
5.轉(zhuǎn)化。
6.挑選多個克�。ū热�100-200個）到1.5ml EP管，直接誘導(dǎo)表達（記得帶上為改造克隆菌株的對照）。
7.SDS-PAGE檢測。
8.挑選高表達的多個克隆，測序。
客服一
