質(zhì)粒提不出來或得率較低咋辦？
閱讀次數(shù)：813 發(fā)布時間：2021/5/28 10:23:37
1.大腸桿菌老化：請涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。
2. 質(zhì)�？截悢�(shù)低：由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。
3. 菌體中無質(zhì)粒：有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。例如，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中長期保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時應(yīng)接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。
4. 堿裂解不充分：使用過多菌體培養(yǎng)液，會導(dǎo)致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液P1、P2和P3的用量。對低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時可加大菌體用量并加倍使用溶液P1、P2和P3，可以有助于增加質(zhì)粒提取量和提高質(zhì)粒質(zhì)量。
5. 溶液使用不當(dāng)：溶液P2、P3在溫度較低時可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。
6. 吸附柱過載：不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB或2×YT，菌液體積必須減少；若質(zhì)粒是非常高的拷貝數(shù)或宿主菌具有很高的生長率，則需減少LB培養(yǎng)液體積。
7. 質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時) ：洗脫溶解質(zhì)粒時，可適當(dāng)加溫或延長溶解時間。
8. 乙醇?xì)埩簦浩匆合礈旌髴?yīng)離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。
9. 洗脫液加入位置不正確：洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到蕞大洗脫效率。
10. 洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB(10mM Tris-HCl, 1mMEDTA，pH8.5)或水。洗脫效率還取決于pH值，大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當(dāng)用水洗脫時確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過低可能導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。
11. 洗脫體積太�。合疵擉w積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。
12. 洗脫時間過短：洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時放置1分鐘可達(dá)到較好的效果。
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