做
蛋白表達(dá) 實驗的時候，有時候?qū)嶒灂X得參考實驗方法和克隆的蛋白基因序列完全沒有問題，蛋白電泳就是沒有結(jié)果。遠(yuǎn)慕生物為大家總結(jié)和一些網(wǎng)絡(luò)資源匯總了下蛋白不表達(dá)的原因。
1.載體 構(gòu)建錯誤。這個屢見不鮮，很多克隆新人經(jīng)常弄錯讀碼框。比如Qiagen的pQE系列載體，其克隆位點(diǎn)常有一兩個堿基的區(qū)別;另外有些酶產(chǎn)生粘端有些酶產(chǎn)生平端，這些都容易導(dǎo)致讀碼框錯誤，從而表達(dá)不出來。
2.宿主菌選擇不當(dāng)。不同的宿主菌其基因型是不一樣的。有些經(jīng)過特殊修飾的載體 ，或者特殊用途的載體，或者有特殊啟動子的載體，必須選擇合適的宿主菌進(jìn)行表達(dá)。因此，當(dāng)你的蛋白沒有表達(dá)出來時，可以考慮更換宿主菌。
3.密碼子的使用頻率低。有些基因其本身含有許多稀有密碼子，尤其是起始密碼之后的15個堿基之內(nèi)的稀有密碼子，對蛋白表達(dá)有著很重要的影響。優(yōu)化密碼子對原核表達(dá)似乎效果很好，對真核表達(dá)系統(tǒng)未見得有很好的效果。
曾經(jīng)有某人在畢赤酵母表達(dá)某蛋白兩年未果，試圖將密碼子優(yōu)化進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果還是沒有表達(dá)。一氣之下將該優(yōu)化的基因序列克隆到原核表達(dá)載體 ，表達(dá)量居然出奇地高!這是一個辛酸的笑話，但是一個真實的故事。
但是有一點(diǎn)我可以有很大把握的說：對于真核表達(dá)，密碼子優(yōu)化只能起錦上添花的作用（確認(rèn)有表達(dá)，以此來提高表達(dá)量），而不能雪中送炭（沒有表達(dá)出來，通過密碼子優(yōu)化有可能不奏效）。
4、質(zhì)粒不穩(wěn)定或者質(zhì)粒丟失。pET系統(tǒng)通常比較穩(wěn)定。但是你選用帶氨芐青霉素抗性的載體時，也許有可能產(chǎn)生β-lactamase降解了抗生素，使質(zhì)粒丟失。還有一種情況是表達(dá)重組 的毒素蛋白，對宿主細(xì)胞也有毒性，造成質(zhì)粒丟失。這種情況多見于真核表達(dá)系統(tǒng)。
5、蛋白酶將蛋白降解了。這種情況常由重組蛋白本身的N-或C-端序列引起的。當(dāng)?shù)鞍譔-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或 Tyr這些氨基酸時，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端規(guī)則。
N-端是Met時，大腸桿菌可以悄悄地把這個Met偷走，特別是Met后緊跟著一個帶小側(cè)鏈的氨基酸時。C-末端存在非性氨基酸時，也容易導(dǎo)致蛋白被降解。C末端后5個氨基酸是性的或者帶電荷的，則不易被降解。
6、二翻譯起始位點(diǎn)。這種情況見于你的序列里正好含有和核糖體結(jié)合位點(diǎn)完全一致的序列。那就怪不得人家了，核糖體會很高興地找到這個位點(diǎn)，然后開始翻譯，致使你的蛋白被截短，在電泳時看不到預(yù)期大小的片段。
7、SD序列。這個不陌生吧?考研時老師喜歡出名詞解釋，也難怪人家老是拿這個出題－－－－SD序列和起始密碼子序列（80%是AUG，也有GUG的）之間的距離，對蛋白表達(dá)的效率也有著非常重要的影響。SD序列本身的組成對翻譯效率也有影響。有時為了減少包涵體的產(chǎn)生，還特別對SD序列進(jìn)行修飾呢!
8、 mRNA的二結(jié)構(gòu)。在克隆之，你得看看你的序列里是否有和核糖體結(jié)合位點(diǎn)和/或翻譯起始位點(diǎn)互補(bǔ)的序列。如然，你好進(jìn)行同義密碼子替換。否則由此形成的mRNA二結(jié)構(gòu)，會讓翻譯嘎然而止的。
9、意外終止。這種情況見于PCR擴(kuò)增序列時，會和你開個不大不小的玩笑。比如它會將序列中間TAC突變?yōu)門AA，讓你的蛋白翻譯剎車。所以在進(jìn)行表達(dá)之，一定要進(jìn)行測序，避免這種情況的發(fā)生。
10、轉(zhuǎn)錄終止子。轉(zhuǎn)錄終止子的存在可以促進(jìn)蛋白表達(dá);但是缺少時就會造成“通讀”，沒完沒了地讀下去。這在pET系統(tǒng)里不成問題，因為它在靶基因的相反方向有個選擇性的標(biāo)記基因。如果你的靶基因正好和這個標(biāo)記基因方向一致，那么你得看看你的靶基因后是否有個轉(zhuǎn)錄終止子。如果沒有的話，它們會競爭得天昏地暗，著生成mRNA和蛋白質(zhì)。
11、 mRNA的不穩(wěn)定性。靶基因的mRNA常聚集于細(xì)胞內(nèi)。但是大腸菌的mRNA及其不穩(wěn)定。如果在mRNA的5＇-非翻譯區(qū)和3‘-rho非依賴性終止子處插入穩(wěn)定結(jié)構(gòu)序列，可以促進(jìn)mRNA的穩(wěn)定性。尤其是5＇末端要是有個不帶突出的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，能讓mRNA在胞漿內(nèi)無生命之虞。
12、檢測方法的可行性。有時候，蛋白的確表達(dá)了，只是表達(dá)量特別低，或者和雜帶靠得特別近，致使你錯誤地以為蛋白沒有表達(dá)。這時候，你可千萬別忘記了生物學(xué)實驗的兩大黃金準(zhǔn)則：對照和重復(fù)。說到對照，有很多層意思�；镜囊馑际�，要設(shè)立空載體對照。
在真核系統(tǒng)表達(dá)的蛋白，常常量特別低。因此你不要老是想著WB和SDS-PAGE去檢測。這時候，你必須多看文獻(xiàn)，另辟蹊徑，從文獻(xiàn)中找找看這個蛋白有米有很特別的性質(zhì)－－－－比如說如果它具有酶活性，那簡直就是便宜你了。
還比如說，某些蛋白具有異樣性質(zhì)，比如說流感病毒的HA，你拿表達(dá)的不同梯度稀釋的蛋白做個血凝。如果發(fā)生血凝，并且呈現(xiàn)一定的梯度關(guān)系，那簡直就是板上釘釘?shù)氖虑榱恕?br />
總結(jié)起來，任何實驗實驗材料都相當(dāng)重要，蛋白表達(dá)載體構(gòu)建正確是蛋白表達(dá)實驗的基礎(chǔ)，因此務(wù)必要保證蛋白表達(dá)載體正確性，合適的宿主菌也是蛋白表達(dá)實驗的基礎(chǔ)。
客服一
