、DNA提取過程中各種試劑的作用及原理
DNA提取過程中各種試劑的作用及原理
1.溶液I—溶菌液：
溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中pH小于8時(shí)，溶菌酶作用受到抑制。
葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。
EDTA：
(1)螯合Mg2+、Ca2+等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用(DNase作用時(shí)需要定的金屬離子作輔基);
(2)EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。
2.溶液II-NaOH-SDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。但當(dāng)pH>12或pH<3時(shí)，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。 在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1/L，加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6， 因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。
SDS：
SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：
(1)溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與
蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。
(2)解聚細(xì)胞中的核蛋白。
(3)SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-…R+-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。 但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下步操作中 (用RNase去除RNA時(shí))受到干擾。
3. 溶液III－－3mol/L NaAc(pH4.8)溶液：
NaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。 所以該溶液實(shí)際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調(diào)回pH至中性， 使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol/L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、 RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾桑瑴p少相斥力而互相聚合.
二、提取DNA常用的方法
.酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎細(xì)胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯DNA大小為100-150kb
二.甲酰胺解聚法：破碎細(xì)胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，再透析獲得DNA可得DNA200kb左右。
三.玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細(xì)胞，將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DNA沉淀液繞于玻棒。生成DNA約80kb。
四.異丙醇沉淀法：基本同1法，僅用二倍容積異丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA(在異丙醇中可溶狀態(tài))
五.表面活性劑快速制備法：用Triton X-100A或NP40表面活性劑破碎細(xì)胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。
六.加熱法快速制備：加熱96℃-100℃，五分鐘，然后離心后取上清，可用于PCR反應(yīng)。
七.堿變性快速制備：先用NaOH作用20分鐘，再加HCI中和，離心后取上清，含少量DNA。
三、為什么用無水乙醇沉淀DNA
用無水乙醇沉淀DNA，這是實(shí)驗(yàn)中常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶， 乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。
DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的終含量占67%左右。 因而也可改用95%乙醇來替代無水乙醇(因?yàn)闊o水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95%乙醇昂貴)。
但是加95%的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有定程度的溶解，因而DNA損失也增大， 尤其用多次乙醇沉淀時(shí)，就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時(shí)可用95%乙醇代替無水乙酵， 后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。般在室溫下放置15-30分鐘即可。
四、用乙醇沉淀DNA時(shí)為什么定要加NaAc或NaCl
在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷， 減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時(shí)， 只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時(shí)， 其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。
加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用SDS與KAc來處理?
加進(jìn)去的RNase本身是種蛋白質(zhì)，為了純化DNA，又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復(fù)合物沉淀，再加KAc使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使沉淀更加完全。也可用飽和酚、*抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較好效果。
在基因操作實(shí)驗(yàn)中，磷酸鹽緩沖系統(tǒng)(pKa=7.2)和硼酸系統(tǒng)(pKa=9.24)等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2+產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀，在DNA反應(yīng)時(shí)，不同的酶對輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCl(pKa=8.0)的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時(shí)，大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定。
客服一
