午夜一级毛片,欧美久久久久久性大战),制服丝袜综合中文字幕,日本久久一区二区视频网站链接

凝膠遷移實(shí)驗(yàn)有稱凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA，electrophoretic mobility shift assay），是一種用于蛋白與核算相互作用的技術(shù)。*初是用于轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子相互作用的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，也可應(yīng)用與蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。

一、實(shí)驗(yàn)原理

EMSA主要基于蛋白-探針復(fù)合物在在凝膠電泳過程中遷移較慢的原理。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)特異性和非特異性探針，當(dāng)核酸探針與樣本蛋白混合孵育時(shí)，樣本中可以與核酸探針結(jié)合的蛋白質(zhì)與探針形成蛋白-探針復(fù)合物；這種復(fù)合物由于分子量大，在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)遷移較慢，而沒有結(jié)合蛋白的探針則較快；孵育的樣本在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜后，蛋白-探針復(fù)合物會(huì)在膜靠前的位置形成一條帶，說明有蛋白與目標(biāo)探針發(fā)送互作。

二、實(shí)驗(yàn)操作步驟

1、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

（1）合理的實(shí)驗(yàn)方案

根據(jù)研究目的合理設(shè)計(jì)特異性探針實(shí)驗(yàn)組以及非特異性探針對(duì)照組，如有必要還可以添加特異性抗體組、特異性核酸競(jìng)爭組等

（2）樣本制備

可以選擇提取樣本的總蛋白、核蛋白或者使用純化好的目的蛋白。對(duì)樣本蛋白進(jìn)行定量，實(shí)驗(yàn)中等量加入蛋白。

（3）探針制備

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)計(jì)不同的探針并添加標(biāo)記，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商業(yè)化的抗體也可以直接購買�，F(xiàn)在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)不再使用放射性標(biāo)記，生物素使用相對(duì)較多。

2、形成蛋白-探針復(fù)合物

（1）在0.5ml離心管中按順序?qū)⑾铝薪M份混勻：

（2）冰浴5min后，加入1μ探針。（對(duì)照組加1ul對(duì)照探針）

（3）PCR儀中室溫（20-23℃）溫育30min。

3、制備凝膠，電泳

（1）制備6.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠：（注意根據(jù)試劑情況按比例調(diào)整總體積）

（2）按標(biāo)準(zhǔn)步驟制備凝膠。

（3）加樣前先在預(yù)冷的0.5X TBE buffer中120V預(yù)電泳10min，與電泳完畢后沖洗加樣孔。

（4）混合樣本及電泳緩沖液，點(diǎn)樣電泳。

（5）將電泳槽置于冰上或者4℃環(huán)境中，恒壓100V進(jìn)行電泳，直至緩沖液指示帶距離凝膠底部2~3cm為止。（大約50-60min，根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整電泳時(shí)間及電壓；電泳時(shí)間不宜過長）

4、轉(zhuǎn)膜

（1）在預(yù)冷的0.5XTBE中浸泡凝膠，膜，濾紙和纖維墊。

（2）按如下順序組裝“三明治”：纖維墊，濾紙，凝膠，膜，濾紙，纖維墊。注意電極，確保凝膠位于陰極、膜位于陽極。

（3）在預(yù)冷的0.5XTBE中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜裝置應(yīng)置于冰上或者低溫室中，恒壓60V轉(zhuǎn)膜1h。（注意根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整電壓及時(shí)間）。

5、檢測(cè)

（1）去除轉(zhuǎn)好的膜，放入合適的盛有緩沖液的容器中，沖洗。（注意整個(gè)檢測(cè)過程避免膜干燥）

（2）去掉沖洗緩沖液，加入封閉液后輕微震蕩，室溫封閉20min。

（3）加入適量的HRP酶標(biāo)記的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP conjugate），室溫震蕩孵育45min。（勿將酶標(biāo)記物直接加到膜上）

（4）去掉酶聯(lián)物稀釋液，用洗滌緩沖液洗膜三次，每次室溫輕微震蕩1 0min。

（5）配置反應(yīng)底物，均勻加至膜上，室溫孵育5min。（可以在加完底物后，用薄膜輕輕覆蓋在膜上，是底物均勻覆蓋，注意不要產(chǎn)生氣泡）

1、為什么看不到遷移帶？

1）蛋白樣本提取質(zhì)量不高，蛋白降解或者提取量不足。

2）樣本中沒有可以與探針結(jié)合的蛋白。

3）探針與蛋白無特異性的相互作用。

4）轉(zhuǎn)膜效率低，蛋白或者探針未轉(zhuǎn)移到膜上。

5）曝光或者成像時(shí)間過短。

在Super-Shift EMSA測(cè)定中看不到Super-Shift DNA/蛋白復(fù)合物帶還可能有以下原因：

6）抗體沒有工作。不是所有的抗體都可以用于Super-Shift EMSA，只有對(duì)非變性蛋白的表面抗原決定簇起反應(yīng)的抗體才能夠用于Super-Shift EMSA。

7）測(cè)定的活化的DNA/蛋白復(fù)合物中沒有希望檢測(cè)的構(gòu)成成分存在。此時(shí)既看不到Super-Shift的帶，也看不到DNA/蛋白復(fù)合物的量的減少

8）使用的抗體過度稀釋。一般10-20ul的反應(yīng)液需要使用0.5-1ul原倍的抗體。

9）多抗與DNA/蛋白復(fù)合物形成大的聚集物而不進(jìn)膠。在這種情況下，雖然看不到Super-Shift的帶，但應(yīng)當(dāng)可以看到DAN/蛋白復(fù)合物的電泳帶明顯減少。

2、為什么實(shí)驗(yàn)背景高？

1）曝光或者成像時(shí)間過長。

2）封閉時(shí)間不足或者效率不高。

3）洗滌效果不佳。

4）實(shí)驗(yàn)過程中膜沒有一直處于濕潤狀態(tài)。

3、EMSA測(cè)定需要多少量的蛋白與標(biāo)記的探針？

對(duì)每一個(gè)特定的結(jié)合蛋白和探針，所用的純化蛋白，部分純化蛋白，粗制核抽提液需作優(yōu)化：一般所用純化蛋白的量在20-2000ng間，可將蛋白:DNA的等摩爾比調(diào)整為蛋白的摩爾數(shù)是DNA的5倍；用粗制核抽提液，需要2-10ug蛋白形成特異的復(fù)合物。

部分純化蛋白與粗制核抽提液應(yīng)保存在-80℃、探針應(yīng)保存在-20℃以防止降解。

無論探針或是結(jié)合蛋白都應(yīng)避免多次凍融。

4、Poly(dI:dC)，非特異性競(jìng)爭DNA，特異性競(jìng)爭DNA在EMSA測(cè)定中的作用？

Poly(dI:dC)由肌苷和胞嘧啶組成。在EMSA反應(yīng)中加入poly(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與標(biāo)記探針的非特異結(jié)合。結(jié)合溶液中的poly(dI:dC)的用量需在正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行優(yōu)化，一般用量大約在0.05mg/ml左右。當(dāng)用純化的蛋白作凝膠遷移反應(yīng)時(shí)，不必一定加入poly(dI:dC)，如加入，則普通反應(yīng)中所用終濃度不超過50-100ng。對(duì)核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)。

為確定所形成的復(fù)合物的特異性，在含或不含增量的特異競(jìng)爭DNA或非特異的競(jìng)爭DNA時(shí)，作結(jié)合反應(yīng)的競(jìng)爭實(shí)驗(yàn)。一般，特異競(jìng)爭探針是非標(biāo)記的DNA，其序列與標(biāo)記探針相同，故能與標(biāo)記探針競(jìng)爭與結(jié)合蛋白的反應(yīng)。非特異競(jìng)爭探針的長度組成和DNA探針相同，但序列不同。如果結(jié)合蛋白與標(biāo)記探針的結(jié)合被特異競(jìng)爭探針抑制，而不受非特異探針的影響表明靶結(jié)合蛋白的存在。特異與非特異性競(jìng)爭DNA的用量也需優(yōu)化或滴定，但競(jìng)爭DNA通常是標(biāo)記的探針用量的30-100倍（w/w）。

5、用什么凝膠條件將蛋白質(zhì)/探針復(fù)合物和游離的探針分離開？

將結(jié)合蛋白或粗制核抽提液和目的探針結(jié)合，蛋白/探針復(fù)合物和游離探針可在非變性聚丙烯酰胺凝膠中經(jīng)電泳分離。聚丙烯酰胺的濃度一般為6%，在特定條件下可用高或低的濃度。也可將TGE緩沖液（12.5mM Tris，pH8.3，95mM 甘氨酸，0.5mM EDTA）用于不穩(wěn)定的蛋白/DNA復(fù)合物。在4℃進(jìn)行結(jié)合和電泳實(shí)驗(yàn)以阻止不穩(wěn)定復(fù)合物和探針的解離。

當(dāng)帶型不緊密出現(xiàn)拖尾時(shí)，表明復(fù)合物存在解離。凝膠必需完全聚合，以避免帶型拖尾。如復(fù)合物不進(jìn)入凝膠則表明所用的蛋白或探針過量，或鹽的濃度過量不適用于這一反應(yīng)。在含抽提液的帶中不含游離探針或復(fù)合物，但只含探針的帶中有探針表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，應(yīng)在抽提液中和結(jié)合反應(yīng)中加入相應(yīng)的抑制劑。