污染是
細胞培養(yǎng)的大敵。預(yù)防和避免污染是細胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。
一開始就要十分重視，防止污染，否則會前功盡棄，不僅浪費時間，而且浪費人力、物力，甚至造成無法彌補的損失。
（一）污染的類型
細胞培養(yǎng)過程中的污染不僅僅指微生物，而且還包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中的、對細胞生存有害或造成細胞不純的物質(zhì)，包括生物和化學物質(zhì)。
1、細菌污染
細菌污染是實驗室細胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素，也可能因為操作不慎而引起污染。*常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。
培養(yǎng)細胞受細菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，*后變圓脫落死亡。
2、真菌污染
真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中*常見的一種，*常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。
培養(yǎng)細胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點，有的散在生長，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間或
培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。
真菌污染后，細胞生長變慢，但*后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。
3、支原體污染
支原體是介于細菌與病毒之間能獨-立生活的*小微生物，*小直徑0.2μm，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細胞表面或散在于細胞之間。
培養(yǎng)細胞受支原體污染后，部分敏感細胞可見細胞生長增殖變慢，部分細胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產(chǎn)生交叉污染。
4、病毒污染
組織細胞培養(yǎng)過程中，如果沒有除去潛在的病毒，就會產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。
盡管病毒污染的細胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。
5、非同種細胞污染
由于細胞培養(yǎng)操作時各細胞株所需的器材和
溶液沒有嚴格分開，往往會使一種細胞被另一種細胞污染。目前，世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染，致使許多實驗宣告無效。
非細胞培養(yǎng)物所造成的化學成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學物質(zhì)所致。
（二）、污染的鑒別
1、細菌、真菌污染的檢測
（1）肉眼觀察
細菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發(fā)生，而且增生迅速，若有污染，在48小時內(nèi)可明顯觀察到，例如培養(yǎng)液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。
（3）接種觀察
采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可發(fā)現(xiàn)是否有污染。
（2）鏡下觀察
在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細菌污染。
若細胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染。
2、支原體污染的檢測
（1）相差顯微鏡觀察
直接取少許培養(yǎng)液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察，支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細胞與細胞之間，有時可見類似于布朗運動的表現(xiàn)。
應(yīng)注意與細胞破碎溢出的內(nèi)容物如線粒體等相區(qū)別。
（2）熒光染色法觀察
用熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結(jié)合，可使支原體內(nèi)的DNA著色，熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點，散在于細胞周圍或附于細胞表面。
A positive
（3）電鏡檢測
若條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細胞培養(yǎng)48～72小時，細胞接近匯合前，用胰酶消化細胞制成細胞懸液后進行固定、包埋、切片后才能進行觀察。
客服一
