IHC 實(shí)驗(yàn)從操作上來(lái)講并不算難，但是由于操作步驟較多，因此造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想的因素較多，曾有人總結(jié)出「九九八十一難」，現(xiàn)在我們就 IHC 操作常遇到的一些問(wèn)題及其解決方法進(jìn)行匯總，希望能解決你的 IHC 問(wèn)題。
1.
抗體濃度過(guò)高
一抗?jié)舛冗^(guò)高是造成切片染色深常見(jiàn)的原因。解決辦法是在每次使用新抗體前對(duì)其工作濃度進(jìn)行測(cè)試，使每一抗體個(gè)體化，找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度，包括即用型的抗體也同樣需要進(jìn)行測(cè)試，不能只簡(jiǎn)單的按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。
2. 抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度較高
為了避免這種情況出現(xiàn)，相關(guān)人員應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘，及時(shí)提醒，避免因遺忘而造成時(shí)間延長(zhǎng)。現(xiàn)在流行的二步法敏感性很高，要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的 1 小時(shí)，而是 30 分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。
3. DAB 變質(zhì)和顯色時(shí)間太長(zhǎng)
DAB 現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣，應(yīng)進(jìn)行過(guò)濾后再使用。配制好的 DAB 不應(yīng)存放時(shí)間太長(zhǎng)，因?yàn)樵跊](méi)有酶的情況下，過(guò)氧化氫也會(huì)游離出氧原子與 DAB 產(chǎn)生反應(yīng)，從而降低 DAB 的效力；像未用完的 DAB 存放在冰箱里，需要的時(shí)候再取用的這種行為也是不可取的。DAB 的顯色在顯微鏡下監(jiān)控，待達(dá)到理想的染色程度時(shí)，應(yīng)立即終止反應(yīng)。
當(dāng)由于染色片太多或使用染色機(jī)，導(dǎo)致無(wú)法及時(shí)進(jìn)行終止操作時(shí)，也應(yīng)該盡量對(duì)新的，或使用頻率不高的抗體，進(jìn)行顯色時(shí)的監(jiān)控，避免顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
4. 組織變干
修復(fù)液溢出后未及時(shí)補(bǔ)充液體、染色切片太多、動(dòng)作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。這就要求相關(guān)人員在操作過(guò)程中要做到仔細(xì)認(rèn)真，并采用 DAKO 筆或 PAP Pen 在組織周?chē)?huà)圈，達(dá)到有效的避免液體流失，提高操作速度的效果。
5. 切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間大于 24 小時(shí)
具體原理不清楚，但現(xiàn)象確實(shí)存在。有的實(shí)驗(yàn)室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在 4oC 冰箱過(guò)夜，對(duì)結(jié)果無(wú)明顯影響；如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，則會(huì)出現(xiàn)背景著色。因此，不可存放時(shí)間太長(zhǎng)。
6. 一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體
由于過(guò)期的抗體會(huì)導(dǎo)致切片不顯色或者背景著色，所以應(yīng)當(dāng)注意一抗的有效期。
用新買(mǎi)抗體時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和用使用過(guò)的抗體作比較。
7. 忘記血清封閉
在免疫組化中使用封閉血清，可以消除非特異性染色，提高目的
蛋白的準(zhǔn)確性和降低背景。封閉血清一般選擇和二抗來(lái)源相同的，因此常用山羊血清。有時(shí)也會(huì)使用小
牛血清、BSA、羊血清等，但不可與一抗來(lái)源相同。
8. 操作過(guò)程中脫片
（1）可能是黏附載玻片質(zhì)量的問(wèn)題，建議嘗試更換載玻片。
（2）組織切的不好，可能是切片機(jī)刀片較鈍造成切片切的厚、不均勻，或者是切片機(jī)操作者手法不熟練等。
（3）可能是組織的問(wèn)題，比如癌癥組織有壞死情況時(shí)，也容易造成脫片。
（4）烘烤結(jié)果不理想，可能是烘烤時(shí)間較短或溫度不夠等。
（5）操作時(shí)甩動(dòng)幅度過(guò)猛，有脫片嫌疑的切片不甩或輕輕甩，可用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水。
（6）修復(fù)過(guò)程出現(xiàn)問(wèn)題，比如在抗原修復(fù)時(shí)，高壓時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，或者放進(jìn) 100 度修復(fù)液時(shí)不夠平穩(wěn)，也容易出現(xiàn)脫片的情況。此外，用 EDTA 修復(fù)比檸檬酸更容易脫片。
（7）一旦見(jiàn)到有組織漂起來(lái)，在操作時(shí)就要更加謹(jǐn)慎，使用 PBS 的時(shí)候盡量泡，不要沖。
客服一
