構(gòu)建穩(wěn)定細胞株概述
構(gòu)建穩(wěn)定細胞系的基本原理是將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上，載體被轉(zhuǎn)染到宿主細胞并整合到宿主染色體中，用載體中所含的抗性標志進行篩選，*常用的真核表達載體的抗性篩選標志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，常用G418來代替新霉素進行選擇性篩選，篩選得到可穩(wěn)定表達目的
蛋白，或者穩(wěn)定表達沉默特定基因的細胞株。
1. 2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的構(gòu)建
原理：
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，就是轉(zhuǎn)染的
質(zhì)粒DNA整合到宿主細胞染色體上，使宿主細胞可
長期表達目的基因及蛋白。需要在瞬時轉(zhuǎn)染基礎(chǔ)上對靶細胞進行篩選或者應(yīng)用高轉(zhuǎn)染效率的病毒，根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應(yīng)的藥物進行細胞傳代，從而得到可穩(wěn)定表達目的基因的細胞系。
應(yīng)用：
觀察目的基因及其表達蛋白在某種細胞中的功能（穩(wěn)定，可長期進行研究）
一般流程：
1） 篩選濃度測定：以10~14天細胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度
2） 細胞接種：轉(zhuǎn)染實驗前天接種細胞，各種細胞的平板密度依據(jù)各種細胞的生長率和細胞形狀而定。進行轉(zhuǎn)染當天細胞密度應(yīng)達到60%~80%覆蓋
3） 細胞轉(zhuǎn)染（病毒、脂質(zhì)體、電穿孔、FuGENE 6）
4） 利用質(zhì)粒上含有的抗性選擇進行篩選
5） 鑒定篩選結(jié)果
前期需要準備：
構(gòu)建好的外源基因載體
待轉(zhuǎn)染的細胞系（1×106個細胞，可傳代，倍增時間小于48小時）以及
細胞培養(yǎng)條件的說明
若需要檢測靶基因的表達變化，請?zhí)峁┫鄳?yīng)
抗體結(jié)果呈現(xiàn)：構(gòu)建好的穩(wěn)定表達細胞系及相關(guān)的外源基因表達分析
客服一
