內(nèi)參
抗體可用于評(píng)價(jià)
蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)的效率，比較凝膠中每孔的蛋白上樣量。此類對(duì)照可幫助確定樣品間表達(dá)水平的差異，以判斷是由
細(xì)胞裂解物的實(shí)際蛋白水平導(dǎo)致，還是由上樣量的差異導(dǎo)致。
內(nèi)參抗體在目標(biāo)蛋白的免疫熒光研究中，也可以作為共染的陽性對(duì)照。內(nèi)參抗體分為未標(biāo)記型和標(biāo)記型，標(biāo)記物包括生物素、HRP、FITC、PE、Cy染料和Alexa Fluor染料。
內(nèi)參抗體種類很多，比如β-actin、β-tubunlin、GAPDH、Vinculin、Lamin B、PCNA等，其選擇常使我們困惑。本文將簡單介紹選擇內(nèi)參抗體應(yīng)遵循的五項(xiàng)原則：
一、樣本種屬來源：
首先要考慮實(shí)驗(yàn)樣本來源于什么物種。
1. 哺乳動(dòng)物的組織或者細(xì)胞樣本，通常選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,Katpase等。
2. 植物來源實(shí)驗(yàn)樣本，則可以選擇plant actin、Rubisco等。
3. 其他來源樣本研究較少，所以就應(yīng)該參照文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，選擇合適的蛋白作為內(nèi)參。
二、分子量大�。�
選擇內(nèi)參抗體時(shí)，應(yīng)該考慮目的蛋白分子量的大小，一般保證目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5KD以上。例如，目的蛋白分子量為40KD，此時(shí)不適宜選擇β-actin、與GAPDH作為內(nèi)參，可以考慮選擇α-Tubulin或者β-tubulin作為內(nèi)參。
三、表達(dá)水平：
選擇的內(nèi)參蛋白需要在待測樣本中是高表達(dá)的。常用的內(nèi)參蛋白是由管家基因高表達(dá)的，是細(xì)胞發(fā)育和維持細(xì)胞活力所必須的。例如，細(xì)胞核的內(nèi)參蛋白 PCNA，在 DNA S 期表達(dá)，因此對(duì)于非增殖細(xì)胞不推薦使用。
四、表達(dá)因素：
選擇蛋白表達(dá)不受實(shí)驗(yàn)變量影響的內(nèi)參。
●在做多組織多細(xì)胞樣本對(duì)比表達(dá)量時(shí)，zui好選用 GAPDH作為內(nèi)參，因?yàn)镚APDH是代謝類蛋白，在活組織中表達(dá)比較恒定。而β-Actin和β-Tubulin是結(jié)構(gòu)蛋白，不同組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)會(huì)有差異性；
●而在某些細(xì)胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會(huì)導(dǎo)致GAPDH的表達(dá)增高，不適合做內(nèi)參；
●涉及細(xì)胞增殖的相關(guān)試驗(yàn)中，c-Jun由于自身表達(dá)變化不適合做內(nèi)參；
●凋亡實(shí)驗(yàn)時(shí)，TBP、Lamin等也不適合作為內(nèi)參；
●做誘導(dǎo)后樣本或檢測磷酸化等修飾性抗體時(shí)，應(yīng)選擇結(jié)構(gòu)蛋白作為內(nèi)參，如β-Actin 和β-Tubulin；
●做各種分泌液樣本的時(shí)候，如血漿、乳汁、組織液等，由于沒有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，只能選擇一些分泌蛋白作為內(nèi)參。
客服一
