質粒ＤＮＡ小量制備的問題與對策：
裂解和煮佛法都極其可靠，重復性也很好，而且一般沒有會么麻煩。多年來，在我們實驗室中日常使用這兩種方法的過程中，只碰到過兩個問題：
１）有些工作者首次進行小量制備時，有時會發(fā)現(xiàn)質粒DNA不能被限制酶所切割，這幾乎總是由于從細菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時注意得不夠。大多數(shù)情況下，用酚：氯仿對
溶液進行抽提可以去除小量備物中的雜質。如果總是依然存在，可用離心柱層析注純化DNA。
２）在十分偶然的情況下，個別小時制備物會出現(xiàn)無質粒DNA的現(xiàn)象。這幾乎肯定是由于核酸沉淀顆粒已同乙醇一起被棄去。
三、質粒ＤＮＡ的大量制備
在豐富
培養(yǎng)基中擴增質粒
細菌的收獲和裂解
收獲
堿裂解法
（一）在豐富培養(yǎng)基中擴增質粒
許多年來，一直認為在氯霉素存在下擴增質粒只對生長在基本培養(yǎng)基上的細菌有效，然而在帶有pMBl或ColEl復制子的高拷貝數(shù)質粒的大腸桿菌菌株中，采用以下步驟可提高產(chǎn)量至每500ml培養(yǎng)物2－5mg質粒DNA，而且重復性也很好。
１）將30ml含有目的質粒的細菌培養(yǎng)物培養(yǎng)到對數(shù)晚期（DNA 600約0.6)。培養(yǎng)基中應含有相應抗生素，用單菌落或從單菌落中生長起來的小量液體閉關物進行接種。
２）將含相應抗生素的500ml ＬＢ或Terrific肉湯培養(yǎng)基（預加溫至37℃）施放入25ml對數(shù)晚期的培養(yǎng)物，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)25小時（搖床轉速300轉/分），所得培養(yǎng)物的OD 600值約為0.4。
３）可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇），使終濃度為170μg/ml。像pBR322一類在宿主菌內(nèi)只以中等拷貝婁竿行復的質粒，有必要通過擴增。這些質粒只要從生長達到餉新一代的質粒（如pUC質粒）可復制達到很高的拷貝數(shù)，因此無需擴增。這些質粒只要從生長達到飽和的細菌培養(yǎng)物即可大量提純。但用氯霉素進行處理，具有抑制細菌復制的優(yōu)點，可減少細菌裂解物的體積和粘稠度，極大地簡化質粒純化的過程。所以一般說來，盡管要在生長中的細菌培養(yǎng)物里加入氯霉素略顯不便，但用氯霉素處理還是利大于弊。
４）于37℃劇烈振搖（300轉/分），繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時。
（二）細菌的收獲和裂解
１．收獲
１）用合適轉頭于4℃以4000轉/分離心15分鐘，棄上清，敞開離心管口并倒置離心管使上清全部流盡。
２）將細菌沉淀重懸于100ml用冰預冷的STE中。
STE
0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
２）按步驟１）所述方法離心，以收集細菌
細胞。
２，堿裂解法
１）將冼過的500ml 培養(yǎng)物的細菌沉淀物[ 來自收獲細菌的步驟3] 重懸于10ml（18ml）溶液Ｉ中。
溶液Ｉ
50mmol/L葡萄糖
25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
10mmol/L EDTA(pH8.0)
溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于４℃。
２）加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。當溶液的pH值低于8.0時，溶菌酶不能有效工作。
３）加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH(臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋）
1％SDS
蓋緊瓶蓋，緩緩顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物。于室溫放置5-10分鐘。
４）加15nl(20ml)用冰預冷的溶液Ⅲ。
溶液Ⅲ
5mol/L乙酸鉀 60ml
冰乙酸 11.5ml
水 28.5ml
所配成的溶液對鉀是３mol/L，對乙酸根是5mol/L。
封住瓶口，搖動離心瓶數(shù)次以混勻內(nèi)容物，此時應不再出現(xiàn)分明的兩個液相。置冰上放10分鐘，應形成一白色絮狀沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀應包括染體DNA、 高分子量RNA和鉀－SDS－
蛋白質－膜復合物。
５）用合適轉頭于4℃以4000轉/分離心15分鐘，不開剎車而使轉頭自然停轉。如果細菌碎片貼壁不緊，可以5000轉/分再度離心20分鐘， 然后盡可能將上清全部轉到另一瓶中，棄去殘留在離心管內(nèi)的粘稠狀液體。未能形成致密沉淀塊的原因通常是由于溶液Ⅲ與細菌裂解物混合不充分[步驟４）]。
６）上清過濾至一250ml離心瓶中，加0.6體積的異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘。
７）用合適轉頭于室溫以500轉/分離心15分鐘，回收核酸。如于4℃離心，鹽也會了生沉淀。
８）小心倒掉上清，敞開瓶口倒置離心瓶使殘余上清液流盡，于室溫用70％乙醇洗滌沉積管壁。倒出乙醇，用與真空裝置相聯(lián)的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室溫將瓶倒置放在紙巾上，使*后殘余的痕量乙醇揮殆盡。
９）用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。
10）純化。
四、質粒ＤＮＡ的純化
聚乙二醇沉淀法質粒ＤＮＡ
氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環(huán)ＤＮＡ
（一）聚乙二醇沉淀法提取質粒ＤＮＡ
１）將核酸溶液所得]轉入15mlＣorex 管中， 再加3ml 用冰預冷的5mol/L LiCl溶液，充分混勻，用合適轉頭于４℃下以10 000轉/分離心10分鐘。LiCl可沉淀高分子RNA。
２）將上清轉移到另一30mlCorex管內(nèi)，加等量的異丙醇， 充分混勻， 用SorvallSS34轉頭（或與其相當?shù)霓D尖）于室溫以10 000轉/分離心10分釧， 回收沉淀的核酸。
３）小心去掉上清，敞開管口，將管倒置以使*后殘留的液滴流盡。于室溫用70％乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，用與真空裝置相連的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞開管口并將管侄置，在紙巾上放置幾分鐘，以使*后殘余的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。
４）用500μl含無DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml ）的TE（pH8.0）溶解沉淀，將溶液轉到一微量離心管中，于室溫放置30分鐘。
５）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量
離心機于４℃以12000g離心５分鐘，以回收質粒ＤＮＡ。
６）吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解質粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽１次。
７）將水相轉到另一微量離心管中，加100μl 10mol/L乙醇銨，充分混勻，加２倍體積（約1ml）乙醇，于室溫放置10分鐘，于4℃以12 000g離心5分鐘，以回收沉淀的質粒ＤＮＡ。
８）吸去上清，加200μl處于4℃以12 000g離心2分鐘。
９）吸去上清，敞開管口，將管置于實驗桌上直到*后可見的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。
10）用500μl TE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀釋[用TE（pH8.0)] 后測量OD 260，計算質粒DNA的濃度（1OD260＝50μg質粒DNA/ml）， 然后將DNA貯于－20℃。
（二）氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環(huán)ＤＮＡ
此方法可獲的較高質量的質粒DNA，但耗時且費用昂貴目前較少采用，這里不多綴述。
客服一
