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全轉(zhuǎn)錄組這么火，怎么做？小編帶您一文參透全轉(zhuǎn)錄組測序的研究套路！

一、什么是全轉(zhuǎn)錄組？

全轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細(xì)胞在特定狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出的所有轉(zhuǎn)錄本信息的總和，包含mRNA，small RNA，lncRNA，circRNA等編碼和非編碼RNA。轉(zhuǎn)錄組學(xué)作為科學(xué)研究的基礎(chǔ)，其研究意義的重要性眾所周知。近年來，除了魅力不減當(dāng)年的miRNA、炙手可熱的lncRNA外，ceRNA分析也開始嶄露頭角，成為科研界的耀眼明星。

二、為什么做全轉(zhuǎn)錄組測序？

想解答這個問題，咱們先來聊聊什么是ceRNA。

ceRNA (competing endogenousRNA，競爭性內(nèi)源RNA) 并不是新的RNA分子，而是一種全新的基因表達(dá)調(diào)控模式，ceRNA假說揭示了一種RNA間相互作用的新機制。

ceRNA—競爭性內(nèi)源RNA

mRNA或ncRNA上存在可被miRNA結(jié)合的區(qū)域，即MREs功能元件，包含同源MREs的RNA分子可競爭性的結(jié)合miRNA。已知miRNA可通過結(jié)合靶基因?qū)е禄�因沉默，所以ceRNA可以通過競爭性地結(jié)合miRNA來調(diào)控靶基因的表達(dá)[1]。

目前，單一的mRNA或ncRNA研究已不能滿足科研需求，結(jié)合多種RNA信息進行ceRNA聯(lián)合分析，探究其潛在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機制已成為解釋生物學(xué)現(xiàn)象的利器！

三、全轉(zhuǎn)錄組測序怎么做？

全轉(zhuǎn)錄組測序即應(yīng)用RNA-seq技術(shù)，通過構(gòu)建兩種文庫—小RNA文庫和去核糖體的鏈特異性文庫，可一次性分析4種RNA (miRNA，lncRNA，mRNA，circRNA) 信息。

3.1分析內(nèi)容

全轉(zhuǎn)錄組分析內(nèi)容更全面，除4種RNA標(biāo)準(zhǔn)分析外，還包含ceRNA聯(lián)合分析，更可附贈高級分析內(nèi)容，超值超優(yōu)惠！

全轉(zhuǎn)錄組測序信息分析流程

ceRNA互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[2]

3.2 研究思路

全轉(zhuǎn)錄組測序研究思路

1）確定研究對象
對照組&處理組；健康組&疾病組；癌組織&癌旁組織……
2）應(yīng)用RNA-seq獲得4種RNA數(shù)據(jù)
3）篩選差異表達(dá)的mRNA，lncRNA，miRNA，circRNA
4）構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選ceRNA-mRNA調(diào)控pairs
5）QRT-PCR驗證其表達(dá)量相關(guān)性
6）ceRNA調(diào)控關(guān)系驗證
a. 從蛋白水平、RNA水平等驗證ceRNA對靶標(biāo)基因的作用；
b. 分析miRNA結(jié)合位點，ceRNA-miRNA調(diào)控關(guān)系；
7）功能驗證
a. 細(xì)胞水平：細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡及周期變化，腫瘤轉(zhuǎn)移等；
b. 分子水平：Western Blot和免疫組化，siRNA干擾/過表達(dá)載體，免疫沉淀（IP）等；
c. 動物實驗：構(gòu)建動物模型，腫瘤模型；
d. 臨床層面：檢測動物表型及生化指標(biāo)變化，術(shù)后恢復(fù)情況。

3.3 案例解析

實踐是檢驗真理的標(biāo)準(zhǔn)，文章是總結(jié)思路的一大法寶！近期發(fā)表在Nature communications的兩篇文章，分別以lncRNA，circRNA為主要研究點，結(jié)合mRNA，miRNA數(shù)據(jù)進行ceRNA分析，探究其調(diào)控機制。

1. 前列腺癌中l(wèi)ncRNA介導(dǎo)的sponge調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[3]

研究表明，lncRNA可作為miRNA海綿競爭性結(jié)合mRNA。文章通過生物信息學(xué)分析篩選到2個sp-lncRNA，并確定PTEN為其調(diào)控基因，通過miRNA發(fā)揮作用，從而表明lncRNA介導(dǎo)的海綿調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在癌癥調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

2. circRNA的miRNA海綿作用機制[4]

文章應(yīng)用RNA-seq技術(shù)篩選差異circRNAs，確定circHIPK3為目標(biāo)分子，并進行鑒定及生成、胞內(nèi)定位等研究；通過miRNA結(jié)合位點分析并結(jié)合多重實驗驗證，表明circHIPK3可作為miRNA海綿發(fā)揮調(diào)控作用。