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人源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指利用基因 工程技術(shù)，將動(dòng)物體內(nèi)的免疫球蛋白基因 用人類(lèi)的免疫球蛋白基因替換，從而使轉(zhuǎn) 基因動(dòng)物體內(nèi)的人免疫球蛋白基因發(fā)生 重排和突變，直接表達(dá)產(chǎn)生人類(lèi)的抗體蛋 白，利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物重排后的人抗體基因 序列或抗體蛋白，通過(guò)細(xì)胞工程和蛋白質(zhì) 工程技術(shù)手段，制備出臨床使用的人源化 抗體，用于重大疾�。ㄈ缒[瘤）的治療或 突發(fā)性生物安全事件（如SARS、EBOLA 等）的防控。截至2015年底，60余個(gè)來(lái)源 于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的人源化抗體進(jìn)入臨床試驗(yàn) 階段，其中8個(gè)獲得FDA批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)應(yīng) 用。人源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已成為抗體開(kāi) 發(fā)的核心工具動(dòng)物，對(duì)改善人民群眾的健 康水平和保障公共衛(wèi)生安全方面具有重要 的作用和意義。

1　人源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的發(fā)展歷程 人源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的培育大致

可分為三個(gè)不同的發(fā)展階段：代人 源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物主要以能在動(dòng)物體 內(nèi)產(chǎn)生人類(lèi)的抗體蛋白為標(biāo)志；第二代 人源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物增加了轉(zhuǎn)入的人 免疫球蛋白基因片段，使人類(lèi)抗體在動(dòng) 物體內(nèi)重排多樣性得到進(jìn)一步增加；第 三代人源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物重點(diǎn)解決了 轉(zhuǎn)入的人免疫球蛋白基因片段與動(dòng)物B細(xì) 胞發(fā)育的匹配性問(wèn)題，使得抗體的產(chǎn)量 和質(zhì)量進(jìn)一步提升。

1.1　代人源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

Brüggemann博士于1989年*早報(bào)道 人類(lèi)免疫球蛋白基因能在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行 重排和表達(dá)，在技術(shù)上驗(yàn)證了培育轉(zhuǎn)基 因動(dòng)物生產(chǎn)人類(lèi)抗體的可行性1 。隨后， Lonberg小組和Green小組在1994年分別成 功培育出了人源化抗體轉(zhuǎn)基因小鼠，使 培育人源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)人類(lèi)抗 體蛋白成為現(xiàn)實(shí)2 3 。

早期的人源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物直接 將人的免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)， 使其重排產(chǎn)生人類(lèi)抗體蛋白。但由于動(dòng) 物會(huì)優(yōu)先使用自身的免疫球蛋白基因， 因此轉(zhuǎn)入的人免疫球蛋白基因的重排和 表達(dá)受內(nèi)源性免疫球蛋白基因影響較 大，為克服這一問(wèn)題，培育的代人 源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是在轉(zhuǎn)入人免疫球 蛋白基因的同時(shí)，對(duì)動(dòng)物內(nèi)源性免疫球 蛋白基因（重鏈、к輕鏈和λ輕鏈）進(jìn)行 失活4 。

1.2　第二代人源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

人免疫球蛋白重鏈（hIgH）基因約 有1250kb，人免疫球蛋白к輕鏈（hIgκ） 基因約1820kb，人免疫球蛋白λ輕鏈 （hIgλ）基因約900kb。要在體外獲得如 此長(zhǎng)的基因片段并將其完整導(dǎo)入到動(dòng)物 體內(nèi)、實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定遺傳具有較高的技術(shù)難 度。500kb的基因片段是體外基因操作的 極限5 ，因此，代人源化抗體轉(zhuǎn)基因 動(dòng)物中的人免疫球蛋白基因已進(jìn)行了改 造，一般轉(zhuǎn)入500kb以下的免疫球蛋白基 因片段，盡管能夠獲得人類(lèi)抗體蛋白， 但受轉(zhuǎn)入基因片段調(diào)控區(qū)的限制，其重 排多樣性受到制約。

第二代人源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是在 代基礎(chǔ)上，重點(diǎn)解決免疫球蛋白超 大基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因、增加人類(lèi)抗體重排 多樣性的問(wèn)題。第二代人源化抗體轉(zhuǎn)基 因動(dòng)物利用胚胎干細(xì)胞和基因同源重組技 術(shù)，采用多次介導(dǎo)小片段基因轉(zhuǎn)入和體內(nèi) 同源重組技術(shù)實(shí)現(xiàn)了完整的人免疫球蛋白 基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)入，使抗體重排多樣性得到保 障。但這一技術(shù)目前已有保護(hù)，進(jìn)行 商業(yè)化開(kāi)發(fā)需要獲得許可。

1.3　第三代人源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

免疫球蛋白除了能夠重排表達(dá)形成 抗體外，在B細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中也扮演 重要的角色。B細(xì)胞發(fā)育早期階段所需 的B細(xì)胞受體（B cell receptor，BCR） 由免疫球蛋白重鏈與信號(hào)蛋白Igα和Igβ 分子組成。在人源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 中，BCR中人的免疫球蛋白重鏈與動(dòng)物 自身信號(hào)蛋白的Igα和Igβ的相互匹配性 并不是*優(yōu)的，因此對(duì)B細(xì)胞的早期發(fā) 育、B細(xì)胞分化抗體類(lèi)型轉(zhuǎn)換、親和力成 熟都具有重要的影響6 。

為解決以上問(wèn)題，VelocImmune和 Kymab人源化抗體轉(zhuǎn)基因小鼠僅將小鼠 免疫球蛋白的V區(qū)、D區(qū)和J區(qū)全部替換為 人免疫球蛋白V區(qū)、D區(qū)和J區(qū)，解決早期 B細(xì)胞發(fā)育的問(wèn)題，抗體的表達(dá)量和親和力得到進(jìn)一步的改進(jìn)，但其產(chǎn)生抗體為 人鼠嵌合抗體，需要二次改造才能形成 全人源化抗體6 7 。2016年，重慶市畜牧 科學(xué)院成功培育出中國(guó)的人源化抗體轉(zhuǎn) 基因小鼠（CAMouse），其采用時(shí)空特異 性表達(dá)技術(shù)，在B細(xì)胞發(fā)育的早期階段， 免疫球蛋白重排形成鼠源BCR，解決B細(xì) 胞發(fā)育的匹配性問(wèn)題，而在B細(xì)胞發(fā)育到 漿細(xì)胞階段，免疫球蛋白重排直接表達(dá) 形成人類(lèi)抗體蛋白，這樣轉(zhuǎn)基因小鼠B細(xì) 胞的早期發(fā)育、B細(xì)胞分化抗體類(lèi)型轉(zhuǎn) 換、親和力正常。

2　主要人源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系

由于人源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育難度 較大，截至2015年底，全球僅有少數(shù)幾家 單位成功培育出能生產(chǎn)全人源化抗體的轉(zhuǎn) 基因動(dòng)物，其他抗體研發(fā)公司基本上都是 與以上單位進(jìn)行合作利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研制 人源化抗體。此外，Therapeutic Human Polyclonals Inc（THP）、Ablynx、Origen Therapeutics、Revivicor等公司目前也在利 用兔、駱駝、雞和豬開(kāi)展人源化抗體轉(zhuǎn)基 因動(dòng)物的研究，但尚在進(jìn)行之中，因此本 小節(jié)僅介紹已培育成功的世界主流人源化 抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物8 9 。

2.1　XenoMouse 小鼠

XenoMouse小鼠是由Cell Genesys公 司的Green博士領(lǐng)銜培育出的代人源 化抗體轉(zhuǎn)基因小鼠。早期的XenoMouse 轉(zhuǎn)入的人免疫球蛋白基因片段僅含有5個(gè) 重鏈V區(qū)和2個(gè)к輕鏈V區(qū)，后經(jīng)優(yōu)化升 級(jí)，目前XenoMouse攜帶有人IgH和Igк的 主要基因序列，其中人IgH約1.0Mb（含 有34個(gè)V區(qū)，23個(gè)D區(qū)，6個(gè)J區(qū)，以及 Cμ、Cδ），人Igк約0.8Mb（包括32個(gè)V 區(qū)，完整的J區(qū)，C區(qū)，KDE，Igк intronic 和3’增強(qiáng)子），而小鼠自身的IgH和Igк已 被失活。該品系小鼠可以識(shí)別人類(lèi)的蛋 白作為抗原，產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)。利用 XenoMouse小鼠，從體內(nèi)免疫到利用雜交 瘤技術(shù)篩選出人源化抗體，只需3個(gè)月的 時(shí)間，篩選出的抗體親和力可達(dá)pM10。1996 年，Cell Genesys公司將XenoMouse小鼠 業(yè)務(wù)分拆出來(lái)成立Abgenix公司，2005 年，Amgen公司花費(fèi)22億美元，收購(gòu)Abgenix 公司11。

2.2　UltiMab 小鼠

UltiMab小鼠與XenoMouse小鼠同步 出現(xiàn)，由美國(guó)Medarex公司Lonberg博士 領(lǐng)銜培育而成。UltiMab小鼠與XenoMouse 小鼠性質(zhì)類(lèi)似，轉(zhuǎn)入了人IgH和 Igк的主要基因，同時(shí)使小鼠自身的IgH和 Igк失活，差異在于UltiMAb小鼠采用原 核注射的方式培養(yǎng)，而XenoMouse采用酵 母原生質(zhì)融合的方式培育而成2 。Ulti- MAb小鼠經(jīng)過(guò)幾代的發(fā)展，已由*初的3 個(gè)重鏈V區(qū)、4個(gè)к輕鏈V區(qū)發(fā)展成能產(chǎn)生 所有抗體亞型的人源化抗體轉(zhuǎn)基因小 鼠，并開(kāi)發(fā)了30余個(gè)抗體藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)4 。2009年，百時(shí)美施貴寶支付 24億美元收購(gòu)Medarex公司12。

2.3　Harbour 小鼠

Harbour公司目前擁有H2L2和 HCAB兩個(gè)品系的小鼠。H2L2小鼠內(nèi) 源性的抗體表達(dá)被失活，同時(shí)轉(zhuǎn)入了 嵌合的人/大鼠/小鼠的免疫球蛋白基 因。其轉(zhuǎn)入的免疫球蛋白重鏈基因包 括18個(gè)人的V區(qū)，19個(gè)人的D區(qū)，6個(gè) 人的J區(qū)，大鼠的C區(qū)及小鼠的LCR 區(qū)，轉(zhuǎn)入的免疫球蛋白к輕鏈包括11 個(gè)人的V區(qū)，5個(gè)人的J區(qū)，1個(gè)大鼠的 C區(qū)，同時(shí)在大鼠C區(qū)的兩側(cè)各有1個(gè) 小鼠的增強(qiáng)子。其產(chǎn)生的抗體親和力 可達(dá)（p～n）Molar。HCAB品系為單 鏈特異性抗體轉(zhuǎn)基因小鼠，小鼠自身 的重鏈C區(qū)和к輕鏈被敲除，轉(zhuǎn)入的人 免疫球蛋白重鏈基因部分包括8個(gè)人 V3區(qū)，1個(gè)人V6區(qū)，人AIID區(qū)和6個(gè) 人的J區(qū)，同時(shí)還帶有小鼠Cγ和小鼠 LCR區(qū)。該品系小鼠可用于雙功能抗 體和四價(jià)抗體的開(kāi)發(fā)13。

2.4　OmniAb

OmniAb目前擁有3個(gè)不同品系的 人源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，即Omni- Rat、OmniMouse以及OmniFlic，由英 國(guó)Marianne Brüggemann博士主導(dǎo)培育 而成。OmniRat攜帶有嵌合的人／大 鼠免疫球蛋白重鏈基因（包括22個(gè)人 V區(qū)，所有的人D區(qū)和J區(qū)，以及大鼠 的C區(qū)）和人的免疫球蛋白輕鏈（12 個(gè)人к輕鏈V區(qū)和Jk-Ck，16個(gè)人λ輕鏈 V區(qū)和Jλ-Cλ），同時(shí)利用鋅指核酸酶 對(duì)大鼠內(nèi)源性免疫球蛋白基因進(jìn)行滅 活。OmniRat具有正常大鼠相近的免 疫功能，免疫1只OmniRat，通過(guò)雜交 瘤技術(shù)可獲得約1600個(gè)克隆，其中陽(yáng) 性克隆為148個(gè)（正常SD大鼠約可獲 得3520個(gè)克隆）。 OmniMouse小鼠培 養(yǎng)方式與OmniRat類(lèi)似，但其攜帶的 人免疫球蛋白V區(qū)要多于OmniRat。 OmniFlic是用于單鏈抗體開(kāi)發(fā)的人源 化抗體轉(zhuǎn)基因大鼠，與OmniRat相 比，僅在人免疫球蛋白輕鏈方面存在 差異，OmniFlic僅攜帶有重排后的單 個(gè)Vk-Jk-Ck，其可避開(kāi)雜交瘤技術(shù)獲 得抗體基因的相關(guān)信息14。2013年， 藥明康德宣布引入OmniRat開(kāi)展人源 化抗體合作研究15。

2.5　VelocImmune 小鼠

VelocImmune小鼠是美國(guó)Regeneron 公司培育的人源化抗體轉(zhuǎn)基因小 鼠，其將小鼠IgH和Igк的V區(qū)精確地 替換為對(duì)應(yīng)的人IgH和Igк的V區(qū)，保 留了小鼠自身的所有C區(qū)及其他基因 表達(dá)調(diào)控元件。通過(guò)連續(xù)三次同源重 組，VelocImmune小鼠*終攜帶了人 IgH的80個(gè)V區(qū)和Igк的40個(gè)V區(qū)。該小 鼠具有正常小鼠類(lèi)似的免疫反應(yīng)特性 和抗體產(chǎn)量，已開(kāi)發(fā)了10余種抗體進(jìn) 入臨床試驗(yàn)階段，但該小鼠存在的問(wèn) 題是產(chǎn)生的抗體是人鼠嵌合抗體，需 要進(jìn)行二次改造才能實(shí)現(xiàn)全人源化7 。

2.6　Kymab 小鼠

Kymab小鼠由英國(guó)Kymab公司和 Sanger研究所共同培育而成，其構(gòu)建 策略與VelocImmune小鼠類(lèi)似，也是將 小鼠IgH和Igк的V區(qū)精確地替換為對(duì)應(yīng) 的人IgH和Igк的V區(qū)，保留了小鼠自身 的所有C區(qū)及其他基因表達(dá)調(diào)控元 件6 。細(xì)微的差別是VelocImmune小鼠 采用的經(jīng)典的同源重組策略實(shí)現(xiàn)完整 的V區(qū)替換，而Kymab是采用的Cre介 導(dǎo)的同源重組技術(shù)實(shí)現(xiàn)完整的V區(qū)替 換，雙方的沖突較大，2016年 10月，英國(guó)Kymab公司宣布與中國(guó)岸 邁生物科技有限公司進(jìn)行技術(shù)互相授 權(quán)及合作16 。

2.7　CAMAB 小鼠

CAMAB小鼠由中國(guó)重慶市畜牧 科學(xué)院培育而成，包括兩類(lèi)抗體小 鼠：CAMouseHG生產(chǎn)全人源抗體， CAMouseH生產(chǎn)全人源單域抗體（全 人源納米抗體）。CAMouse小鼠攜帶 有經(jīng)改造的人免疫球蛋白重鏈、人免 疫球蛋白к輕鏈和λ輕鏈基因，同時(shí)對(duì) 小鼠內(nèi)源性免疫球蛋白基因進(jìn)行了滅 活。CAMouseHG 和CAMouseH的 特點(diǎn)是具有人/小鼠免疫球蛋白時(shí)空 轉(zhuǎn)換表達(dá)特性，在B細(xì)胞發(fā)育的早期 階段，形成鼠源BCR結(jié)構(gòu)，確保小鼠 B細(xì)胞的正常發(fā)育，在B細(xì)胞發(fā)育至 漿細(xì)胞階段，則又利用人源的Gamma 區(qū)進(jìn)行重排和表達(dá)，生產(chǎn)人源IgG。 CAMouse小鼠的B細(xì)胞發(fā)育正常，抗 體表達(dá)量高，重排多樣性豐富，根據(jù) 目標(biāo)抗體的需要，可以選擇使用抗體 小鼠。

3　人源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用

2006年，利用XenoMouse開(kāi)發(fā)的 panitumumab獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入 臨床使用，這是個(gè)獲批的來(lái)源于 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的人源化抗體，截至2015 年底，共有8個(gè)來(lái)源于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的 人源化抗體獲得FDA批準(zhǔn)（表1）， 適應(yīng)證主要以腫瘤和自身免疫疾病治 療為主， 包括明星抗體P D - 1 與 CTLA-4抗體，均由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物開(kāi)發(fā) 而來(lái)，目前來(lái)源于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的抗 體全球年銷(xiāo)售額已超過(guò)30億美元。 自1996年以來(lái)，共有130余個(gè)人源化 抗體進(jìn)入臨床試驗(yàn)，其中利用人源 化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物共開(kāi)發(fā)了60余種 治療性抗體，約占全部人源化抗體 的一半，已有21個(gè)完成臨床試驗(yàn)， 22個(gè)在進(jìn)行臨床試驗(yàn)（7個(gè)Ⅰ期，14 個(gè)Ⅱ期，1個(gè)Ⅲ期）。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，來(lái) 源于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的全人源化抗體從 Ⅱ期到Ⅲ期以及從Ⅲ期到獲得FDA 許可的比例要高于其他方法制備的 人源化抗體17。

4　人源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 未來(lái)發(fā)展展望

隨著基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展， 未來(lái)將會(huì)在越來(lái)越多的物種上培育出 人源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其功能特性 也將日趨完善，但相關(guān)保護(hù)則是 在培育人源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物初期就 需要優(yōu)先考慮的問(wèn)題。在相當(dāng)長(zhǎng)的一 段時(shí)間內(nèi)，人源化抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物仍 將是人源化抗體開(kāi)發(fā)的一項(xiàng)核心技 術(shù)，而人源化抗體轉(zhuǎn)基因大動(dòng)物和單 鏈抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物將是對(duì)現(xiàn)有人源化 抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的重要補(bǔ)充18。 人源化抗體轉(zhuǎn)基因大動(dòng)物在短期 內(nèi)可以大量產(chǎn)生特異性抗體，在公共 安全事件防控方面具有重要的作用。 盡管日本Kyowa Hakko Kirin公司已培 育出全人源化轉(zhuǎn)基因牛，但由于其采 用的技術(shù)存在一定的缺陷，難以穩(wěn)定 遺傳，目前尚無(wú)法正常使用，需要進(jìn) 一步完善19。在培育大型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 時(shí)，除了通用技術(shù)外，還需要考慮其 繁殖性能、生物凈化難易程度等特 性。綜合考慮，利用豬和兔等大型 或高繁殖性能的動(dòng)物將是未來(lái)的重 要補(bǔ)充。

來(lái)源于駝科的單鏈抗體轉(zhuǎn)基因 動(dòng)物由于分子量小，穿透力強(qiáng)，能夠 通過(guò)常規(guī)抗體無(wú)法到達(dá)的部位，具有 重要的醫(yī)藥價(jià)值，已受到廣泛的關(guān) 注。目前，已有多家單位開(kāi)展單鏈抗 體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的培養(yǎng)，相信這一領(lǐng)域 近期內(nèi)會(huì)取得越來(lái)越多的進(jìn)展。