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材料

緩沖液及溶液

關(guān)于貯存液，緩沖液，試劑組分見附錄 I。
用前稀釋貯存液至合適濃度。

對(duì)照覆蓋溶液（每個(gè)分析的重組噬斑需 6 ml)

10 mmol/LMgSO₄
0.5X LB 培養(yǎng)液
LB 配方見附錄 2，高壓滅菌后加入 1mol/LMgSO₄ 使終濃度為 10 mmol/L, 每個(gè) 150 mm 瓊脂板需 6 ml 本溶液

IPTG 覆蓋溶液（每個(gè)分析重組噬斑需 12 ml)

0.5XLB 培養(yǎng)液
5 mmol/L IPTG
10 mmol/L MgS0₄

LB 配方見附錄 2.0.5xLB 培養(yǎng)液高壓滅菌加 1mol/L IPTG(2.38 gIPTG 溶于終體積為 10 ml 的無菌水中）與 1mol/L MgSO₄ (24.6 gMgSO₄•7 H2O 溶于終體積為 100 ml 的無菌水中)，使其終濃度分別為5nmol/L 和 10mmol/L。每 150 mm 瓊脂板需 12 ml IPTG 覆蓋溶液MgSO4•7 H20(1mol/L)

SM 溶液

培養(yǎng)基

LB 瓊脂板（150 mm)
室溫平衡的新鮮鋪制的平板效果*佳。

含 50ul/ug 氨芐青霉素的 LB 培養(yǎng)液

含 10 mmol/LMgS04 及 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 頂層瓊脂

離心機(jī)及轉(zhuǎn)子
Sorvall SS-34 轉(zhuǎn)子或同等產(chǎn)品

專用設(shè)備

預(yù)設(shè)在 4°C 的空氣培養(yǎng)箱

載體及細(xì)菌株

λgtll 噬菌體重組體
吸單個(gè)噬斑加到約 100ulSM 中室溫放置至少 2 h 制成已知滴度的λ噬菌體重組體貯存液，或通過平板裂解液制備（見第 2 章方案 3)

E.coli Y1090 hsdR 菌株
此菌株可通過 ATCC(www.atcc.org) 獲得，在含有 50ul 氨芐青霉素的 LB 瓊脂板上保存，此菌株在編碼 ATP 依賴的蛋白酶的基因攜帶有突變。在此菌株表達(dá)的融合蛋白比在不攜帶這個(gè)突變的菌株中要穩(wěn)定的多。

方法

1. 取大腸桿菌 Y1090 hsdR 菌株的單個(gè)克隆，接種到 50 ml 含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 培養(yǎng)液中，37°C 過夜培養(yǎng)并溫和振蕩（搖床 250r/min)。

2. 將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫 4000 g(SorvallSS-34 型轉(zhuǎn)子 5800r/min) 離心 5 min。

3. 去上清，用 20 ml10 mmol/LMgSO₄ 重懸細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞懸液稀釋 100 倍時(shí) OD₆₀₀ 值。用 10 mmol/LMgSO₄ 稀釋細(xì)胞懸液使 OD₆₀₀ 值達(dá)到 2.0 OD₆₀₀/ml, 制成鋪板貯存液。

4. 取 3 管 0.2 ml 小份大腸桿菌 Y1090 hsdR 鋪板貯存液轉(zhuǎn)移至新鮮的管中，其中 2 管加 2X10⁵ 到 5x10⁶pfu 的重組λgtll 噬菌體貯存液，第三個(gè)管做未感染對(duì)照。37°C 溫育 20 min, 以使噬菌體吸附到細(xì)胞上。

5. 向一管中加入 7.5 ml 含 10 mmol/LMgS0₄ 及 50ug/ml 氨芐青霉素的熔化的 LB 頂層瓊脂，混勻，迅速將頂層瓊脂鋪到 150 mmLB 瓊脂板上。

6. 重復(fù)步驟 5 直至全部管均完成。

7.42°C 溫育瓊脂板 4 h。

8. 從培養(yǎng)箱中取出平板，向一個(gè)感染的平板加 6 ml 對(duì)照覆蓋液，另外兩管中加 12 mlIPTG 覆蓋液。

9. 重新放回 42°C 培養(yǎng)箱 3~5 h。

10. 從培養(yǎng)箱中取出平板，將覆蓋液轉(zhuǎn)人單個(gè)的無菌管中。
融合蛋白裂解后立即從感染的細(xì)胞中釋放出來與覆蓋液混合。多數(shù)細(xì)菌碎片留在瓊脂糖中而不會(huì)污染覆蓋液。
每 150 mm 平板可產(chǎn)生 200ug 融合蛋白。根據(jù) Huang 和 Jong（1984) 介紹的方法，毎板*多可以重復(fù)銹導(dǎo) 5 次，但表達(dá)量是在前兩次誘導(dǎo)中產(chǎn)生。重復(fù)誘導(dǎo)時(shí)，可移去混有蛋白質(zhì)的覆蓋液，平板在 37°C 復(fù)活 1 h, 再加入新鮮覆蓋液即可。
本方案還可進(jìn)行變通（LillibridgeandPhilipp1993), 表達(dá)目的融合蛋白的重組噬菌體可在大腸桿菌菌苔上形成一個(gè)大的巨型噬斑。將噬菌斑與其下的瓊脂一同挖走. 在勻漿器中破碎，2XSDS 上樣緩沖液中重懸，用于聚丙烯酰胺凝膠電泳及免疫印跡。從制備噬斑開始到凝膠電泳，整個(gè)操作過程需約 6.5 h。

11. 通過免疫印跡檢測(cè)覆蓋液中的融合蛋白。若原始噬菌體是按方案 6 所述的方法分離的，則可用 DNA 結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。
在未感染的培養(yǎng)物或不含 IFTG 覆蓋液中是檢測(cè)不到免疫反應(yīng)性及 DNA 結(jié)合性的。檢測(cè)酶活性時(shí)，分析前覆蓋液應(yīng)用適當(dāng)?shù)木彌_液進(jìn)行透析。

12. 利用試劑盒可通過親和層析純化覆蓋液中的β-半乳糖苷酶融合蛋白（如 Promega Proto Sorb), 或按第 15 章方案 1 中所述方法進(jìn)行。純化蛋白質(zhì)前應(yīng)先對(duì)覆蓋液進(jìn)行透析以除去 IPTG。