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用好的血清，細(xì)胞一定狀態(tài)良好？養(yǎng)細(xì)胞細(xì)心、體貼像照顧小孩紙，細(xì)胞一定「平平安安」？但 MTT 等一些細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻異常。因?yàn)槟愕募?xì)胞已悄悄被支原體污染了。



支原體是一種生命力頑強(qiáng)的細(xì)菌，它和其他細(xì)菌的區(qū)別在于，支原體沒有細(xì)胞壁，只有柔軟的細(xì)胞膜。嬌小的身材（0.15-0.3μm）讓它可以輕松穿過濾器。由于身形小，培養(yǎng)物不會(huì)表現(xiàn)出渾濁或其他明顯可見的特征，因此支原體很容易被忽視。但支原體其實(shí)已經(jīng)隨著操作者的操作「偷偷地」?jié)撊氤瑑艄ぷ髋_(tái)，并附著在血球計(jì)數(shù)器、移液器、廢液缸等物體表面。
 

常見的支原體污染來源有：
1. 受污染的培養(yǎng)基、血清、或試劑
2. 不徹底的滅菌
3. 培養(yǎng)箱：目前常見的培養(yǎng)箱都帶有通氣扇和 CO2 瓶，在開、關(guān)內(nèi)門的過程中，被支原體污染的顆粒會(huì)被擾動(dòng)，可能造成細(xì)胞污染。其他實(shí)驗(yàn)設(shè)備的使用也可能造成污染顆粒的擾動(dòng)，如移液器、離心機(jī)等。
4. 液氮
液氮也可以成為傳播支原體的媒介。支原體具有頑強(qiáng)的生命力，即使沒有經(jīng)過低溫冷藏過程，支原體也可以在液氮里存活。在液氮中，支原體雖然不會(huì)增殖，但是仍可以污染保存在其中的細(xì)胞，因此建議將凍存管保存在液氮罐的氣相層中。
5. 空氣懸浮物
在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的懸浮顆粒是微生物污染的*主要來源，一些常見的儀器或普通的實(shí)驗(yàn)操作都會(huì)產(chǎn)生這些顆粒，例如移液器、真空泵、離心機(jī)、冰箱等。攜帶微生物的顆粒直徑多在 4-28μm 之間，在靜止空氣中，它們以 30 cm/min 的速率移動(dòng)，因此在密閉、不通風(fēng)的房間或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)，基本不會(huì)造成生物污染。但是，當(dāng)實(shí)驗(yàn)者進(jìn)入房間時(shí)，沉積的顆粒會(huì)被擾動(dòng)，懸浮起來的顆粒則有可能污染細(xì)胞。因此嚴(yán)格的無菌操作意識(shí)很重要。此外，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也會(huì)帶來一些被污染的懸浮顆粒。
除上述的情況外，濫用抗生素、密封不嚴(yán)、受污染細(xì)胞等也都可能是支原體污染的來源。
 

支原體污染的危害
1. 支原體導(dǎo)致細(xì)胞密度的減少，并引發(fā)細(xì)胞不可逆的退化。
2. 支原體吸收、破壞培養(yǎng)基中的精氨酸，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、引發(fā)細(xì)胞凋亡，造成細(xì)胞活性降低、細(xì)胞脫落等現(xiàn)象 。更有甚者，也可能導(dǎo)致染色體畸變，因?yàn)榫�氨酸是�?xì)胞核內(nèi)組蛋白的重要成分。
3. 支原體對(duì) MTT 有還原作用，因此常規(guī)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) MTT 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果會(huì)受到支原體的嚴(yán)重干擾；某些支原體也可以直接誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的成熟，這對(duì)于人體免疫細(xì)胞的腫瘤治療來說，無疑是一個(gè)災(zāi)難；除此之外，支原體的存在可以顯著改變數(shù)百個(gè)基因的表達(dá)水平。
由此可見，支原體不僅影響細(xì)胞的健康，也會(huì)影響細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。因此，有必要定期檢測(cè)支原體。
建議在引進(jìn)新細(xì)胞、凍存細(xì)胞前或發(fā)生細(xì)胞房污染等情況時(shí)，及時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行支原體檢測(cè)，平時(shí)對(duì)正常培養(yǎng)的細(xì)胞也有定期檢測(cè)的必要，以做到及時(shí)發(fā)現(xiàn)，及時(shí)處理，避免更大的損失。
 

防止污染的方法：
1. 改進(jìn)無菌技術(shù)、嚴(yán)格無菌操作
對(duì)新進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的人員，要由有經(jīng)驗(yàn)的人員幫帶，嚴(yán)格監(jiān)督其實(shí)驗(yàn)操作；此外建議記錄每一次的污染事件，以便分析解決污染問題。
2. 檢測(cè)外來細(xì)胞
因?yàn)橥鈦淼募?xì)胞攜帶污染很常見，因此，選擇可靠的細(xì)胞來源非常重要。
在沒有獨(dú)立細(xì)胞培養(yǎng)箱的情況下，可疑的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)培養(yǎng)在帶蓋的培養(yǎng)瓶中，不要使用培養(yǎng)板或沒有密封的培養(yǎng)皿。此外，處理這類細(xì)胞應(yīng)在一天工作都結(jié)束后進(jìn)行，并且使用獨(dú)立的培養(yǎng)基和試劑，*后還要對(duì)超凈工作臺(tái)進(jìn)行徹底除菌。
其他方面，如減少懸浮物產(chǎn)生、正確使用抗生素、定期進(jìn)行支原體檢測(cè)等，對(duì)于防止污染也尤為重要。
 

支原體檢測(cè)
ExCell Bio 支原體檢測(cè)試劑盒針對(duì)支原體 DNA 用 PCR 檢測(cè)可疑樣本，其中 PCR 引物通常針對(duì)支原體的 16S rRNA 基因。在凝膠電泳過程中，支原體 DNA 會(huì)顯示為特異性條帶，以指示支原體的存在。
 

支原體檢測(cè)試劑盒特點(diǎn)：
靈敏度高：能夠檢測(cè)大于 10-20 拷貝的靶 DNA；
檢測(cè)范圍廣：涵蓋 54 種支原體，徹底排查污染；
普通 PCR 反應(yīng)即可完成檢測(cè)，操作不復(fù)雜（TAKARA 用巢式 PCR 法、 lonza 用熒光檢測(cè)和熒光定量 PCR 等方法，操作復(fù)雜）；可排除假陰性：宿主陽性對(duì)照，結(jié)果更準(zhǔn)確