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遠(yuǎn)慕:科學(xué)家開發(fā)出大腸桿菌超靈敏快速檢測(cè)法
閱讀次數(shù):1966 發(fā)布時(shí)間:2018/8/20 11:03:10
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據(jù)英國《自然》雜志網(wǎng)站日前報(bào)道,新檢測(cè)方法針對(duì)的是o157:H7型大腸桿菌。這種 細(xì)菌 非常危險(xiǎn),即使食物只被很少幾個(gè) 細(xì)菌 污染,也可能危及人體健康。


對(duì)該細(xì)菌進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)非常重要,但傳統(tǒng)方法必須先對(duì)樣本中的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)、增加數(shù)量,然后進(jìn)行檢測(cè),得出結(jié)果的時(shí)間可能長(zhǎng)達(dá)48小時(shí)。這種拖延對(duì)醫(yī)療和食品工業(yè)都非常不利。


 


新方法用納米級(jí)的二氧化硅粒子進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)納米粒子里都裝有數(shù)以千計(jì)的熒光染色分子,并且每個(gè)納米粒子都附著在一個(gè)該大腸桿菌的 抗體 分子上。


進(jìn)行檢測(cè)時(shí),將食物樣本制成溶液,再把這些納米粒子放進(jìn)溶液。如果樣本里存在大腸桿菌,在抗體分子作用下,納米粒子就會(huì)與大腸桿菌結(jié)合,通過熒光染色分子產(chǎn)生熒光,顯示大腸桿菌的存在。由于一個(gè)納米粒子里就有數(shù)以千計(jì)的熒光染色分子,即使樣本里只有一個(gè)大腸桿菌存在,也可產(chǎn)生足夠強(qiáng)的熒光。
 

實(shí)驗(yàn)原理
感受態(tài)是指細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)。轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)人細(xì)菌的過程。其原理是細(xì)菌處于0℃,CaCl2低滲溶液中,菌細(xì)胞膨脹成球形。
 
 
轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基—鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面,經(jīng)42℃短時(shí)間熱擊處理,促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。將細(xì)菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時(shí)間,促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得的新的表型(如Ampr等)得到表達(dá),然后將此細(xì)菌培養(yǎng)物涂在含有氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基上。
 
 
重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后,還需對(duì)轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行篩選鑒定。利用α互補(bǔ)現(xiàn)象進(jìn)行篩選是*常用的一種鑒定方法,F(xiàn)在使用的許多載體都具有一段大腸桿菌β半乳糖苷酶的啟動(dòng)子及其編碼α肽鏈的DNA序列,此結(jié)構(gòu)稱為lacZ'基因。lacZ'基因編碼的α肽鏈?zhǔn)?beta;半乳糖苷酶的氨基端的短片段(146個(gè)氨基酸)。
 
 
任何攜帶著lacZ'基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化了染色體基因組存在著此種β半乳糖苷酶突變的大腸桿菌細(xì)胞后,便會(huì)產(chǎn)生出有功能活性的半乳糖苷酶,在IPTG(異丙基β-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)后,在含有Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷)的培養(yǎng)基平板上形成藍(lán)色菌落(半乳糖苷酶能將無色的化合物Xgal切割成半乳糖和深藍(lán)色的底物5-溴-4-靛藍(lán))。
 
 
而當(dāng)有外源DNA片段插入到位于lacZ'中的多克隆位點(diǎn)后,就會(huì)破壞α肽鏈的閱讀框,從而不能合成與受體菌內(nèi)突變的β半乳糖苷酶相互補(bǔ)的活性α肽,而導(dǎo)致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶,也就不能分解Xgal而顯藍(lán)色,因此含有重組質(zhì)粒載體的克隆往往是白色菌落。





 


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