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分子信標（Tyagi ａnd Kramer 1996） 是另一種特異的熒光實時 PCR 探針, 這種分子信標可以在體內(nèi)和體外動態(tài)地、實時地檢測核酸 雜交事件（Tyagi ａnd Kramer 1996; Kostrikis et al. 1998; Tyagietal. 1998）。

分子信標是一段雙重標記的寡核苷酸（25~40nt）形成具有一個環(huán)（探針）和一個自身互補的莖的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。熒光報告分子在 5＇端，猝滅劑在 3＇端。

室溫條件下，分子信標形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，熒光報告物質(zhì)和猝滅劑分子通過探針自身互補形成的莖結(jié)構(gòu)緊靠在一起，因此抑 制了熒光信號。

當 PCR 退火時，如果探針遇到靶 DNA 序列，根據(jù)熱力學(xué)原理，信標將優(yōu)先和靶 DNA 結(jié)合而 不是形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。由于莖結(jié)構(gòu)被破壞，熒光報告物質(zhì) 與猝滅劑相互分離，報告物質(zhì)得以發(fā)射熒光。

 

傳統(tǒng)的寡核苷酸雜交必須淸除未雜交的探針分子，以消除背景影響。利用分子信標的雜交在沒有靶 DNA 存在的情況下熒光劑與猝滅劑可以穩(wěn)定地結(jié)合在一起，不發(fā)射熒光，因而 背景很低。因此，可以省略清洗探針這一步，而且，隨著擴增的進行，分子信標結(jié)合于靶 DNA 的比例逐漸增加，發(fā)射的熒光逐漸增強，因此熒光強度與 PCR 產(chǎn)物的累加是直接相 關(guān)的。

 

由于莖環(huán)結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定，分子信標與線性 探針相比具有較高的選擇能力，可以對只有一個 核苷酸差異的靶序列進行辨別，使其成為研究單核苷酸多態(tài)性（SNP） 的理想工具。完全匹 配的探針-靶 DNA 復(fù)合體比分子信標單鏈形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，而發(fā)生錯配的探針-靶 DNA 復(fù)合體一般不太穩(wěn)定，即使只有一個堿基對的錯配也如此，這一熱力學(xué)特征是分子信 標高度特異性的基礎(chǔ)。
 

分子信標在許多定性和定量檢測研究中 應(yīng)用越來越廣泛。它被用于實時檢測 DNA 擴增量的實時 PCR （TyagiandKramer 1996） 它可以用多種染料標記，用來進行實時熒光基因型鑒定（Kostrikisetal. 1998; Tyagietal. 1998） 和在醫(yī)療診斷時同時檢測樣品中不同的病原體（Vet etal. 1999）。

分子信標也可以在活體細胞中檢測 RNA 轉(zhuǎn)錄物（Sokol et al. 1998）、檢測 DNA 結(jié)合蛋白（HeydUkandHeyduk 2002）。分子信標還可以應(yīng)用于實時 PCR、端點 PCR 和 RT-PCR 實驗。