【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?br />
（1）學(xué)會(huì)正確使用微生物實(shí)驗(yàn)中常用的接種工具，掌握各種接種技術(shù)。
（2）觀察細(xì)菌的培養(yǎng)特征，學(xué)會(huì)判斷細(xì)菌在不同培養(yǎng)基上的生長狀況。
【實(shí)驗(yàn)原理】
1．無菌接種技術(shù)
無菌接種技術(shù)是微生物研究中基本的操作技術(shù)。所謂接種即把微生物純菌種在無菌條件下移植到適宜的培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)獲得純培養(yǎng)物。因此，接種一般要求在無菌室、超凈工作臺(tái)（圖2-1）或?qū)嶒?yàn)室火焰旁嚴(yán)格按無菌操作進(jìn)行。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌�，采用的接種方法也不同，一般可分為斜面接種、平板接種、液體接種、穿刺接種等。斜面接種：是從已生長好微生物的斜面上挑取少量菌種移植至另一新鮮空白斜面培養(yǎng)基上的接種方法。它是菌種培養(yǎng)的常用方法。平板接種：是用接種環(huán)將菌種接至平板培養(yǎng)基上，或用移液管將一定體積的菌液移至平板培養(yǎng)基上，然后進(jìn)行培養(yǎng)。它主要用于菌落形態(tài)觀察、分離純化菌種、活菌計(jì)數(shù)或其他試驗(yàn)。
穿刺接種：是主要用于接種厭氧菌、檢查細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力或保藏菌種的一種接種方法。接種時(shí)，將沾取菌種的接種針從半固體培養(yǎng)基表面向下穿刺，在接近管底處，接種針再循原路抽出。液體接種：是將斜面菌種或液體菌種接種到液體培養(yǎng)基中的一種方法。它用于菌種的液體培養(yǎng)或液體培養(yǎng)基中生長特征的觀察。
2．細(xì)菌培養(yǎng)特征觀察
培養(yǎng)特征是指微生物在培養(yǎng)基上所表現(xiàn)的群體形態(tài)和生長情況。在一定的培養(yǎng)條件下，不同的微生物培養(yǎng)特征各不相同，這是鑒別各種微生物的依據(jù)。細(xì)菌培養(yǎng)特征一般用固體、半固體和液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)觀察，其中固體培養(yǎng)基又分平板和斜面兩種形式。斜面培養(yǎng)基上的菌苔特征：自下而上在斜面培養(yǎng)基上劃一直線接種，經(jīng)培養(yǎng)，不同的細(xì)菌可以呈現(xiàn)絲狀、刺毛狀、念珠狀、疏松狀、樹枝狀或假根狀等不同的菌苔特征。平板培養(yǎng)基上的菌落特征：把細(xì)菌培養(yǎng)在平板上，主要觀察菌落的形態(tài)、隆起及邊緣等狀況，例如菌落的大小，表面干濕程度，隆起、扁平或凹陷，粗糙或光滑，邊緣整齊或不整齊，菌落透明、半透明或不透明，顏色以及質(zhì)地等，如圖2-2所示。
液體培養(yǎng)基中的生長特征：細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中有三種生長現(xiàn)象。大多數(shù)細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中生長繁殖后呈均勻混濁；少數(shù)鏈狀排列的細(xì)菌（如鏈球菌、炭疽芽孢桿菌）等則呈沉淀生長；枯草芽孢桿菌、結(jié)核分枝桿菌和銅綠假單胞菌等性需氧菌一般呈表面生長，常形成菌膜。半固體培養(yǎng)基中的生長特征：半固體培養(yǎng)基主要用于細(xì)菌動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。有鞭毛的細(xì)菌除了沿穿刺線生長外，在穿刺線兩側(cè)也可見羽毛狀或云霧狀混濁生長。無鞭毛的細(xì)菌只能沿穿刺線呈明顯的線狀生長，穿刺線兩邊的培養(yǎng)基仍然澄清透明。
【實(shí)驗(yàn)器材】
1．菌種大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Stap hyloccocus aureus）、蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoides）、粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）等。
2．培養(yǎng)基牛肉膏
蛋白胨水培養(yǎng)基（斜面、液體、半固體）。
3．
儀器和用具接種環(huán)、接種針、涂棒等接種工具（圖2-3）。試管、移液管、滴管、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)箱、酒精燈等。
【實(shí)驗(yàn)步驟】
1．斜面接種
1）貼標(biāo)簽：接種在距試管口2～3cm位置上貼上標(biāo)簽，注明菌名、接種日期等。
2）點(diǎn)燃酒精燈。
3）手持試管：將試管放于手掌中，并用手指夾住，使兩支試管呈“V”字形。
4）接種環(huán)滅菌（圖2-4）：用火焰將接種環(huán)燒紅，然后將接種環(huán)來回通過火焰數(shù)次。
5）拔管塞：用小指、無名指和手掌拔下試管塞，并夾于手中。試管口緩緩過火滅菌，切勿燒得過燙。
6）取菌種：將燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先將環(huán)接觸一下沒有長菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，再輕輕沾取少量菌體或孢子，然后將接種環(huán)移出菌種管。注意：不要使接種環(huán)的部分碰到管壁，取出后不可使接種環(huán)通過火焰。
7）接種：在火焰旁迅速將沾有菌種的接種環(huán)伸入另一支待接種斜面試管。從斜面培養(yǎng)基的底部向上部做“之”字形密集劃線。注意：切勿劃破培養(yǎng)基。也可用接種針在斜面培養(yǎng)基的中央劃一條直線接種，可觀察不同菌種的生長特點(diǎn)。
8）塞管塞：取出接種環(huán)，灼燒試管口，并在火焰旁將管塞旋上。注意：塞棉塞時(shí)，不要移動(dòng)試管，以免試管在移動(dòng)時(shí)納入不潔空氣。以上所述的無菌操作過程見圖2-5。
9）灼燒接種環(huán)：將接種環(huán)灼燒滅菌后放回原處。
10）培養(yǎng)：將接種好的試管于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后觀察生長情況。
3．液體接種
（1）斜面菌種接種液體培養(yǎng)基
1）接種的操作：同上。
2）接種：用接種環(huán)取少量斜面菌種移入培養(yǎng)基容器（試管或三角燒瓶等）中，將接種環(huán)在液體表面振蕩或與容器壁輕輕摩擦，使菌苔散開。取出接種環(huán)，塞好棉塞，再輕輕搖動(dòng)液體，使菌體均勻分布在液體中。
3）培養(yǎng)：將接種好的試管直立于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后觀察生長情況。
（2）液體培養(yǎng)物接種液體培養(yǎng)基
1）接種的操作：同上。
2）接種：取無菌移液管（或移液器），伸入菌種管內(nèi)吸取適量菌液，轉(zhuǎn)接到待接種的液體培養(yǎng)基內(nèi)。塞好棉塞，再輕輕搖動(dòng)液體，使菌體均勻分布。
3）培養(yǎng)：將接種好的試管直立于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后觀察生長情況。
4．穿刺接種
1）手持試管：按斜面接種法握持菌種管和半固體培養(yǎng)基管，靠近火焰。
2）取菌種：將接種針在火焰上燒灼滅菌，冷卻后從菌種管中挑取少許待接菌菌苔，迅速移至半固體培養(yǎng)基管中。
3）穿刺接種（圖2-6）：將接種針從培養(yǎng)基中央垂直刺入管部3/4深處，然后沿原路抽回。注意：接種針不能在培養(yǎng)基中左右移動(dòng)，只能有一條穿刺線。
）塞管塞：試管口經(jīng)火焰滅菌后，塞上棉塞。灼燒接種針。
5）培養(yǎng)：將接種好的試管置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后觀察生長情況。
5．平板接種
（1）劃線法
1）倒平板（圖2-7）：將融化的瓊脂培養(yǎng)基冷卻至45℃左右，在酒精燈火焰旁，用右手的無名指及小指夾持棉塞，左手打開無菌培養(yǎng)皿蓋的一邊，右手持三角燒瓶向培養(yǎng)皿里注入20mL左右的培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿稍加旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)后，置于水平位置待凝。
2）劃線：在酒精燈火焰上灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，以無菌操作取少量菌苔或菌液，伸入皿內(nèi)，在平板上的一個(gè)區(qū)域沿“之”字形來回劃線（具體方法參見實(shí)驗(yàn)9）。劃線時(shí)，使接種環(huán)在瓊脂表面作輕快滑動(dòng)，切勿劃破表面。
3）培養(yǎng)：劃線完畢后，灼燒接種環(huán)，在皿底用記號(hào)筆注明菌種名稱、日期、姓名（或?qū)W號(hào)），將培養(yǎng)皿倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
（2）三點(diǎn)接種法一般用于霉菌菌落觀察的接種方法。
1）倒平板：同上。
2）三點(diǎn)接種：無菌操作下，用接種針從斜面取少量孢子，針尖垂直地點(diǎn)接在平板培養(yǎng)基表面上，點(diǎn)接三次，接種結(jié)果見圖2-8。注意：三點(diǎn)呈等邊三角狀，三點(diǎn)均位于培養(yǎng)皿的半徑之中心。
3）培養(yǎng)：將平板保持倒置狀態(tài)放入培養(yǎng)箱內(nèi)（切忌來回翻動(dòng)），適溫培養(yǎng)1周。
（3）涂布法
1）倒平板：同上。
2）取菌液：用1mL無菌吸管吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的菌液0.2mL于平板中。
3）涂布：用無菌涂棒在平板表面均勻涂布（圖2-9）。
4）培養(yǎng)：室溫下靜置5～10min后，倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。
【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】
1．實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察并記錄用不同接種方法培養(yǎng)得到的細(xì)菌菌落形態(tài)特征，并列表比較幾種細(xì)菌的菌落特征。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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