重組
蛋白表達(dá)技術(shù)可以用來(lái)分析基因調(diào)控以及研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能。無(wú)論是體內(nèi)功能研究還是用于結(jié)構(gòu)研究的大規(guī)模生產(chǎn)，以及生物治療域的藥物開(kāi)發(fā)都需要用到蛋白表達(dá)技術(shù)。
1、蛋白質(zhì)通用合成路徑
DNA —>mRNA—> 蛋白
實(shí)際操作流程為：
1. 克隆或合成目的基因
2. 載體構(gòu)建
3. 蛋白表達(dá)與純化
4. 蛋白的大量表達(dá)與純化（或無(wú)）
2、克隆或合成目的基因
典型的表達(dá)載體包括至少4個(gè)主要元件：
目的基因表達(dá)框（包括啟動(dòng)子和基因終止或 poly (A) 信號(hào)）
細(xì)菌的復(fù)制起始點(diǎn)（ori）
特定宿主的抗生素選擇框（如潮霉素 B、霉酚酸、嘌呤霉素、殺稻瘟菌素 S 等）
大腸桿菌的抗生素選擇框（如氨芐青霉素、殺稻瘟菌素 S、羧芐青霉素、Zeocin 選擇性抗生素抗性等）
其他元件還包括：
多克隆位點(diǎn)（MCS）（即多酶切接頭）
表位標(biāo)簽
分泌信號(hào)
蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)
內(nèi)部核糖體插入位點(diǎn)（IRES）
3、不同蛋白表達(dá)系統(tǒng)選擇
蛋白表達(dá)是許多小伙伴的實(shí)驗(yàn)課題中的主要內(nèi)容。由于涉及不同的研究域，表達(dá)載體多種多樣，每個(gè)人要表達(dá)的蛋白特性更是千差萬(wàn)別，特別是些小伙伴是第次做課題，關(guān)于怎樣表達(dá)蛋白，怎樣安排實(shí)驗(yàn)步驟更是頭霧水。這里按照不同表達(dá)載體，列舉常用的重組蛋白表達(dá)方案。對(duì)每種蛋白表達(dá)案例從實(shí)驗(yàn)步驟、大只需用時(shí)間以及每個(gè)步驟需要完成的目標(biāo)進(jìn)行比較，大家可以對(duì)照自己的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，希望能有所幫助。
4、常用的蛋白表達(dá)（含細(xì)胞株的制備）：
CHO 穩(wěn)定細(xì)胞株開(kāi)發(fā)
HEK293 穩(wěn)定細(xì)胞株開(kāi)發(fā)
原核蛋白表達(dá)
哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)
酵母蛋白表達(dá)
桿狀病毒與
昆蟲(chóng)細(xì)胞蛋白表達(dá)
5、重組蛋白技術(shù)方案
1. CHO 穩(wěn)定細(xì)胞株開(kāi)發(fā)
2. HEK293 穩(wěn)定細(xì)胞株開(kāi)發(fā)
3. 原核蛋白表達(dá)流程
4. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)流程
5. 酵母蛋白表達(dá)流程
6. 桿狀病毒 - 昆蟲(chóng)細(xì)胞蛋白表達(dá)流程
6、不同蛋白表達(dá)之比較
以上實(shí)驗(yàn)方案的完成時(shí)間是較為成熟的實(shí)驗(yàn)室的工作流程用時(shí)，小伙伴可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)安排靈活掌握。完成目標(biāo)也應(yīng)該根據(jù)自己的課題要求進(jìn)行適當(dāng)增減。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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