如何選擇適合的細(xì)胞增殖檢測方法_技術(shù)文章

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如何選擇適合的細(xì)胞增殖檢測方法
閱讀次數(shù)：319 發(fā)布時間：2020/11/18 9:09:04

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細(xì)胞增殖檢測的應(yīng)用相當(dāng)廣泛，不論是測試藥物試劑還是生長因子的效果，不論是評估細(xì)胞毒性還是分析細(xì)胞活性狀態(tài)，您都可能會用到它。細(xì)胞增殖檢測一般是檢測分裂中的細(xì)胞數(shù)量或者細(xì)胞群體發(fā)生的變化。細(xì)胞增殖檢測主要分為四類：DNA合成檢測、代謝活性檢測、細(xì)胞增殖相關(guān)抗原檢測和ATP濃度檢測。在這些方法中作何選擇，主要取決于您所研究的細(xì)胞類型和研究方案。

DNA合成檢測

DNA合成檢測是目前實驗室中檢測細(xì)胞增殖*準(zhǔn)確可靠的方式。傳統(tǒng)方法是，將放射性標(biāo)記的3H-胸腺嘧啶與細(xì)胞一同孵育幾小時或者孵育過夜。這樣新增殖細(xì)胞的DNA中就會摻入放射性標(biāo)記，經(jīng)洗脫后可用閃爍計數(shù)器SC檢測。該方法時間耗時長而且還有個明顯的弊端，那就是使用和處理放射性物質(zhì)既麻煩又不安全。不過，您還可以使用5-溴-2-脫氧尿苷BrdU來進(jìn)行類似實驗，因為BrdU也同樣可以摻入到新合成的DNA中。不過這樣就需要進(jìn)行額外的實驗步驟，先孵育特異性BrdU單抗和帶標(biāo)記的二抗，然后再進(jìn)行比色法、化學(xué)發(fā)光檢測或熒光信號檢測等步驟。該方法的好處就是讓您不需要再和放射性物質(zhì)打交道。BrdU標(biāo)記很適合免疫組化 IHC、免疫細(xì)胞化學(xué)IC、細(xì)胞內(nèi)ELISA、流式細(xì)胞分析和高通量篩選。

代謝活性檢測

檢測細(xì)胞群體的代謝活性也可以反映細(xì)胞增殖的情況。在細(xì)胞增殖過程中乳酸脫氫酶的活性會增加，因此四唑鹽或者Alamar Blue在代謝活躍的細(xì)胞環(huán)境中會逐漸減少，形成能夠改變培養(yǎng)基顏色的甲臜染料。您可以通過低配置或高配置的分光光度計和酶標(biāo)儀來讀取含染料培養(yǎng)基的吸光度，從而衡量細(xì)胞的代謝活性，檢測細(xì)胞增殖的情況。

四種*-常見的四唑鹽是：MTT、XTT、MTS和WST1。MTT在標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng) 基中是不溶的，而且其生成的甲臜晶體需要溶解在DMSO或者異丙醇中。因此，MTT主要作為終點檢測方法。其他三種鹽與Alamar Blue一樣，都是可溶且無毒的。它們可以作為連續(xù)監(jiān)控手段來跟蹤細(xì)胞增殖的動態(tài)改變。其中XTT的效率較低，需要添加額外的因子。而WST1更靈敏有效，與其他鹽相比能夠更快顯色。Alamar Blue的靈敏度也很高，只要微孔板的孔中有100個細(xì)胞它就能夠檢測到。四唑鹽和Alamar Blue氧化還原染料能夠用于多種儀器和高通量研究，非常方便。它們適用的檢測儀器包括：標(biāo)準(zhǔn)分光光度計、熒光分光光度計和酶標(biāo)儀等。

增殖標(biāo)志檢測

有些抗原只存在于增殖細(xì)胞中，而非增值細(xì)胞缺乏這些抗原，您也可以通過特異性的單抗來對細(xì)胞增殖進(jìn)行檢測。例如，在人體細(xì)胞中，Ki-67抗體識別同名蛋白，在細(xì)胞周期S期、G2期和M期表達(dá)，而在G0期和G1 期(非增殖期)不表達(dá)。用針對Ki-67蛋白的單抗就可以檢測細(xì)胞的增值情況。由于需要組織切片，這種方法無法進(jìn)行高通量分析。不過這一方法頗受癌癥研究者們的青睞，因為它能夠用來檢測體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖。其他普遍使用的細(xì)胞增殖或細(xì)胞周期調(diào)控標(biāo)志還包括，增殖細(xì)胞核抗原PCNA、拓?fù)洚悩?gòu)酶IIB和磷酸化組蛋白H3。

ATP檢測

細(xì)胞內(nèi)的ATP含量受到了嚴(yán)格調(diào)控，檢測ATP也可以得到細(xì)胞增殖的信息。死亡細(xì)胞或即將死亡的細(xì)胞幾乎不含ATP，在細(xì)胞溶解物或提取物中測得的ATP濃度與細(xì)胞數(shù)之間存在嚴(yán)格的線性關(guān)系。利用熒光素酶luciferase及其底物熒光素luciferin的ATP檢測以生物發(fā)光為基礎(chǔ)，能夠為您提供非常靈敏的結(jié)果。如果有ATP存在熒光素酶就會發(fā)光，而且其發(fā)光強度與ATP濃度成正比，用能讀取發(fā)光信號的光度計和酶標(biāo)儀都可以方便的進(jìn)行檢測。這種方法非常適用于高通量細(xì)胞增殖檢測和篩選。

適合才是*-好的

怎樣選擇*-適合自己的檢測方法，這依賴于您的細(xì)胞類型和研究方案，當(dāng)然還取決于您在細(xì)胞增殖中期望得到的信息。舉例來講，假如您已經(jīng)有了待測細(xì)胞(不論是在培養(yǎng)板還是在溶液中)，希望了解細(xì)胞增殖中的代謝活性變化，那您可以使用四唑鹽和比色法檢測。相應(yīng)的，如果您對DNA合成的改變更感興趣，可以選擇用BrdU標(biāo)記，再通過比色法、化學(xué)發(fā)光或熒光檢測進(jìn)行分析。若您研究的是單個細(xì)胞，也可以用BrdU標(biāo)記來檢測DNA合成，將其與熒光標(biāo)記的相應(yīng)抗體結(jié)合，您就可以通過流式細(xì)胞儀來進(jìn)行流式分選。本文介紹的四種方案都是久經(jīng)考驗的可靠方法，選擇*-適合自己的檢測方式，好結(jié)果自然水到渠成。