重組
蛋白表達(dá)在現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)發(fā)展中起著重要的推動作用。通過利用宿主實(shí)現(xiàn)外源性蛋白表達(dá),為一些重要蛋白尤其是人源蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究的提供了強(qiáng)有力的工具。為了能夠進(jìn)行后續(xù)的結(jié)構(gòu)功能研究，所獲得的重組蛋白必須可溶，穩(wěn)定，正確折疊以及具有生物活性。
然而，實(shí)際研究中，這些往往成為獲得一個理想重組蛋白的障礙。重組蛋白表達(dá)的可溶性成為首要解決的問題。因此，許多融合標(biāo)簽被引入。本文介紹下常用的促溶標(biāo)簽特點(diǎn)以及選擇，希望對大家實(shí)驗(yàn)中遇到的重組蛋白溶解性問題有所幫助。
常用促溶標(biāo)簽特點(diǎn)
01 麥芽糖結(jié)合蛋白
麥芽糖結(jié)合蛋白（Maltose binding protein，MBP）是大腸桿菌K12品系中的一個自由蛋白，由malE基因編碼，分子量為42kDa，屬于大腸桿菌吸收和分解麥芽糖通路的一員。
MBP標(biāo)簽*出色的特點(diǎn)是它強(qiáng)大的促溶能力。主要表現(xiàn)在兩方面：促溶范圍廣，促溶效率高。MBP標(biāo)簽得到廣泛應(yīng)用的另一個重要原因是它能夠通過標(biāo)簽和直鏈淀粉特異結(jié)合并在10mmol/L麥芽糖非變性條件下洗脫，從而實(shí)現(xiàn)單極純化。另外，將MBP融合在N端或C端都具有促溶作用。目前已經(jīng)有商業(yè)化的MBP融合標(biāo)簽載體來適應(yīng)研究需要。
02 谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶
谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S- transferase， GST）, *初被發(fā)現(xiàn)于日本血吸蟲，蛋白大小26kDa，是一個常用的可溶性親和純化標(biāo)簽。
GST*突出的優(yōu)點(diǎn)是它能夠與固定的谷胱甘肽產(chǎn)生親和力，在10mmol/L還原型谷胱甘肽的非變性條件下洗脫，*終達(dá)到親和純化目的。GST對重組蛋白還有另一個有利作用，就是減少宿主內(nèi)到那邊的降解，增加蛋白穩(wěn)定性。但是有報(bào)道指出GST的促溶效果并不十分明顯。
03 硫氧還蛋白
硫氧還蛋白（Thioredoxins）是一系列廣泛存在于生物體內(nèi)的氧化還原酶，它能通過置換硫代二硫化物來減少二硫鍵的結(jié)合。常用作融合表達(dá)標(biāo)簽的硫氧還蛋白A(TrxA), 分量為11.6kDa，來源于大腸桿菌。
TrxA標(biāo)簽*獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)是它的熱穩(wěn)定性。TrxA本身不作為親和標(biāo)簽來進(jìn)行重組蛋白優(yōu)化，而是通過在高溫條件下將雜蛋白變性去除而重組蛋白得以保存。TrxA也具有極好的促溶效率，用作促溶標(biāo)簽時可將重組蛋白的可溶性表達(dá)從12%提高至95%。
04 小泛素樣修飾蛋白
小泛素樣修飾蛋白（small ubiquitin-related modifier，SUMO）在真核生物中極為普遍存在，而原核生物中未曾發(fā)現(xiàn)。常用作融合標(biāo)簽的SUMO來源于啤酒酵母，分子量11.5kDa。
SUMO標(biāo)簽的特點(diǎn)是能夠被SUMO蛋白酶特異識別并高效降解，使得后續(xù)標(biāo)簽移除過程準(zhǔn)確高效。SUMO標(biāo)簽不僅能夠加強(qiáng)重組蛋白的可溶性，也能提高其表達(dá)量。
由于真核
細(xì)胞內(nèi)存在內(nèi)源性SUMO蛋白酶，所以野生型SUMO標(biāo)簽不能在真核表達(dá)體系中應(yīng)用。LifeSensors公司已經(jīng)開發(fā)出工程改造的SUMO標(biāo)簽及配套的特異性蛋白酶，使得SUMO標(biāo)簽可以適用于酵母，
昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞等真核表達(dá)體系。
05 NusA標(biāo)簽
NusA蛋白（N-utilization substance A）是大腸桿菌中一類轉(zhuǎn)錄延長的抗終止因子，分子量約55kDa。
由于NusA有著促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)錄和減緩翻譯的生物活性，使得表達(dá)出來的蛋白有更多時間進(jìn)行折疊，能讓重組蛋白得到穩(wěn)定和有活性的表達(dá)，即使不移除NusA標(biāo)簽，融合蛋白依舊能存在活性。
06 其他促溶標(biāo)簽
有很多促溶標(biāo)簽因其自身特有的性質(zhì)，常用作有某種特定性質(zhì)的目的蛋白融合表達(dá)。例如，來源于大腸桿菌的I型蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶DsbA具有高度親水性，能夠促進(jìn)蛋白的可溶性表達(dá)。而且由于DsbA可以利用它具有的信號肽從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞周質(zhì)間隙運(yùn)輸，可以利用這個標(biāo)簽進(jìn)行蛋白分泌表達(dá)。砷酸鹽氧化還原酶（ArsC）可以促進(jìn)有聚集傾向的外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)。
促溶標(biāo)簽新的研究進(jìn)展
串聯(lián)標(biāo)簽的使用
膜蛋白的可溶性表達(dá)
常用促溶標(biāo)簽的新衍生物
新促溶標(biāo)簽的發(fā)現(xiàn)
1.串聯(lián)標(biāo)簽的使用
TrxA, SUMO, NusA等這些促溶標(biāo)簽本身不能用于親和純化，所以需要和其他的親和標(biāo)簽串聯(lián)使用來對融合蛋白進(jìn)行純化，*常見的親和標(biāo)簽為多聚組氨酸標(biāo)簽（his-tag）。
有些重組蛋白純化后，需要將標(biāo)簽蛋白去除，*終獲得目的蛋白進(jìn)行后續(xù)結(jié)果和功能研究。常見做法是在標(biāo)簽蛋白和目的蛋白之前加入特定序列的多肽作為標(biāo)簽移除蛋白酶的識別位點(diǎn)，如腸激酶，Xa因子，TEV以及凝血酶（thrombin）等。這些蛋白酶將標(biāo)簽蛋白切除后，會在目的蛋白N端留下氨基酸殘基，而SUMO標(biāo)簽的蛋白酶能夠特異識別SUMO的三級結(jié)構(gòu)并在其C端Gly-Gly序列后進(jìn)行切除，通過這個方法能獲得具有天然N段的目的蛋白。
不同標(biāo)簽聯(lián)合使用能產(chǎn)生不同的效果，這需要根據(jù)研究需求和目的蛋白特性來進(jìn)行靈活組合，有研究者利用GFP綠色熒光蛋白的熒光特性，將GFP標(biāo)簽和MBP標(biāo)簽以及親和純化標(biāo)簽HIS 三級串聯(lián)，用古語表達(dá)肝素酶I(HepA), 該方法不僅獲得了高純度可溶HepA, 還可以對目的蛋白生產(chǎn)過程中的生物活性實(shí)時監(jiān)控。
2.膜蛋白的可溶性表
膜蛋白存在于脂質(zhì)的生物膜上，具有疏水性，而且重組表達(dá)時容易出現(xiàn)表達(dá)和錯誤折疊等情況，所以膜蛋白的重組表達(dá)有很多困難。我們可以在需要表達(dá)的膜蛋白上融合促溶標(biāo)簽得到可溶重組蛋白。有研究表明，MBP, Trx和SUMO等標(biāo)簽，可以增加膜蛋白的溶解性和表達(dá)量，尤其是小分子量的膜蛋白（10-20kDa）。
3.常用促溶標(biāo)簽的新衍生物
為了使常用促溶標(biāo)簽?zāi)軡M足更多的應(yīng)用需求，可以對現(xiàn)有標(biāo)簽進(jìn)行改造或者尋找標(biāo)簽蛋白的其他物質(zhì)表達(dá)形式。比如為了解決GST融合蛋白寡聚后導(dǎo)致的純化洗脫困難，可以用硫-甲基化谷胱甘肽替代谷胱甘肽提高洗脫效果。來源于熱球菌屬的MBP可以作為耐熱標(biāo)簽來表達(dá)熱穩(wěn)定的重組蛋白。
4.新促溶標(biāo)簽的發(fā)現(xiàn)
一些新興的促溶標(biāo)簽正在不斷被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。比如某些在噬鹽細(xì)菌中應(yīng)用的促溶蛋白正在被研究，并有希望成為獨(dú)特的新型促溶標(biāo)簽。通過人工改造合成的多肽片段也可以作為促溶標(biāo)簽使用。
標(biāo)簽選擇
在選擇促溶標(biāo)簽的時候，應(yīng)該充分考慮各種因素，如該標(biāo)簽是否可以用來親和純化，是否對目的蛋白空間結(jié)構(gòu)和生物活性有影響，以及成本和技術(shù)路線簡單快捷。在充分了解各標(biāo)簽的特點(diǎn)和自身需要的基礎(chǔ)上做出合適選擇。為了快速選擇合適目的蛋白的促溶標(biāo)簽，目前比較可行的一個辦法是在構(gòu)建融合表達(dá)時，平行構(gòu)建多個不同標(biāo)簽的促溶表達(dá)載體，根據(jù)表達(dá)純化結(jié)果，進(jìn)行重組蛋白的生產(chǎn)。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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