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蛋白研究的小伙伴都知道，一個完整的Western Blot包括了很多個步驟，從蛋白提取到配膠、上樣電泳，再到轉(zhuǎn)膜、封閉，*后孵育一抗二抗后才能去進行檢測。時間跨度非常長，而且這中間的每一步都包含了很多的小細(xì)節(jié)，稍有不慎就會導(dǎo)致結(jié)果出錯，然后又得從頭來過。所以，關(guān)于WB，幾乎每一位經(jīng)驗豐富的實驗老手都有著一本厚厚的血淚史。
今天，小編就帶領(lǐng)大家簡要梳理一遍WB流程中的一些細(xì)節(jié)，避免因某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)差錯而導(dǎo)致實驗重做。
Western Blot概述
Western Blot采用的是變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質(zhì)混合物，經(jīng)過SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)被到轉(zhuǎn)移到固相支撐物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持膜上蛋白質(zhì)或多肽的抗原性質(zhì)不變，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與其對應(yīng)的
抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，一抗再與酶標(biāo)記的二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色以檢測特異蛋白質(zhì)表達水平。
由于Western blot技術(shù)服務(wù)具有簡便，快捷等特點，所以目前該技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)表達水平的檢測。
一：樣品的獲取與制備
一般來說我們檢測的樣品主要為
細(xì)胞或者是組織，制備過程中盡量保持低溫。其次在制備時一定要根據(jù)目的蛋白的特性選擇合適的裂解液，比如對膜蛋白的提取、胞漿蛋白的提取和組織蛋白的提取等。
二：配膠、上樣及蛋白電泳
配置凝膠時一定要將膠板清洗干凈，用ddH2O或者無水乙醇潤洗。晾干后根據(jù)蛋白分子量進行不同濃度凝膠配制。上樣時需對蛋白進行煮沸變性，如果進行定量分析一定要將所有蛋白上樣量調(diào)至相同。電泳時低壓（80V）跑濃縮膠，高壓（120v）跑分離膠，至溴酚藍(lán)即將跑出膠面時終止電泳。
三：轉(zhuǎn)膜及封閉
轉(zhuǎn)膜時需提前配置好轉(zhuǎn)膜液并低溫放置。關(guān)于印跡膜來說，目前大多實驗室用的是PVDF膜，根據(jù)目的蛋白大小選擇合適的孔徑，大于20KDa的蛋白選用0.45μm的膜，小于20KDa的蛋白選用0.2μm的膜。PVDF膜在使用時需用甲醇處理活化膜上的正電基團，使其更容易與帶負(fù)電的蛋白結(jié)合。轉(zhuǎn)膜時一定要注意膜和凝膠的正反問題，除此之外一定要注意凝膠和轉(zhuǎn)印膜間不要留有氣泡。封閉液可選擇5%的BSA或5%的脫脂奶粉，可以室溫封閉1-2h或者4℃過夜封閉。封閉時一定要注意對磷酸化的抗體或生物素標(biāo)記的抗體不能用脫脂奶粉封閉膜，只能用5% BSA。
四：抗體的孵育和檢測
一抗二抗的選擇一定要注意種屬來源問題，如果這一步出錯那前面的努力就相當(dāng)于白費了。檢測方法可以選擇靈敏度超高的化學(xué)發(fā)光方法或者現(xiàn)在比較流行的熒光WB法。相較于傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光方法，熒光WB能夠?qū)崿F(xiàn)更精準(zhǔn)的定量，還可以進行多重檢測，只需要將不同的目的蛋白標(biāo)記上不同的熒光就可以了�；谀壳案鞔笃诳s志對WB發(fā)表的要求，全蛋白定量是一種新的趨勢，熒光WB同樣可以實現(xiàn)全蛋白歸一化。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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