不知不覺(jué)地，生物實(shí)驗(yàn)的規(guī)模正在逐漸變小，而通量正在逐漸變大。以往那些龐大的
儀器正被手持設(shè)備或硅制芯片所取代，試劑的單位從毫升轉(zhuǎn)變?yōu)槲⑸蚣{升；而重復(fù)數(shù)量也從兩三個(gè)變?yōu)?6孔、384孔甚至1536孔。因此，實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)也從生物體轉(zhuǎn)換到組織再到
細(xì)胞和細(xì)胞器，包括細(xì)胞核。
從2011年開始，有關(guān)單細(xì)胞核測(cè)序的論文開始出現(xiàn)。通過(guò)谷歌學(xué)術(shù)檢索，篇相關(guān)論文是2011年的一項(xiàng)腫瘤進(jìn)化研究，同年晚些時(shí)候還有一篇苔蘚基因靶向分析的研究發(fā)表。2012年，它被用于腫瘤的拷貝數(shù)變異分析。
近兩年，單細(xì)胞核測(cè)序領(lǐng)域開始迅猛發(fā)展。2018年，僅僅單核RNA-seq（snRNA-seq）就有160多篇論文發(fā)表。這是一種相對(duì)較新的方法，分析的是細(xì)胞核，而不是完整的細(xì)胞。它能夠?qū)﹄y以分離的細(xì)胞開展基因表達(dá)分析。
snRNA-seq采用微流體技術(shù)，將帶有條形碼的微珠和單個(gè)細(xì)胞核一起裝入微小的液滴內(nèi)。這些液滴作為納升級(jí)的反應(yīng)管，實(shí)現(xiàn)了成千上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞核分離和建庫(kù)，從而大幅降低了建庫(kù)的成本。
在有些情況下，細(xì)胞是很難完整分離的，比如長(zhǎng)期保存的組織，或者大腦細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。在分離細(xì)胞時(shí)所用的酶和破壞力往往會(huì)影響其他細(xì)胞區(qū)室的內(nèi)容。此時(shí)，單核RNA測(cè)序就顯得特別重要。
單核RNA測(cè)序有哪些優(yōu)勢(shì)？
根據(jù)我們的直覺(jué)，處理細(xì)胞比處理細(xì)胞核要簡(jiǎn)單得多。從細(xì)胞中獲取細(xì)胞核至少需要兩個(gè)步驟：裂解和離心。人們通常利用去垢劑裂解細(xì)胞，并用Dounce勻漿器均質(zhì)化。之后通過(guò)流式細(xì)胞儀或梯度離心法純化出細(xì)胞核。
然而，單細(xì)胞測(cè)序的準(zhǔn)備過(guò)程往往是造成實(shí)驗(yàn)可變性的主要因素。如何獲得足質(zhì)足量的單細(xì)胞懸液，這是人們面臨的個(gè)難題，特別是那些稀有細(xì)胞或難以解離的細(xì)胞。
對(duì)各種組織而言，細(xì)胞外基質(zhì)組分不同，這使得單細(xì)胞制備的方式也有所不同。人們需要對(duì)細(xì)胞解離的操作方案進(jìn)行個(gè)性化的優(yōu)化。
樣品制備過(guò)程涉及到組織收集、研磨/均質(zhì)化、酶促解離以及稀有細(xì)胞的富集。每一步都可能影響RNA含量，也不能準(zhǔn)確地反映細(xì)胞類型的真實(shí)比例。解離操作往往使樣品偏向于一種或幾種細(xì)胞，從而錯(cuò)過(guò)其他更值得關(guān)注的細(xì)胞。
于是，科學(xué)家和生產(chǎn)商開始引入一些工具和方法，希望盡量減少單細(xì)胞研究中的偏倚。加州大學(xué)歐文分校的一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)出一種微流體裝置，這一裝置利用流動(dòng)限制來(lái)產(chǎn)生高剪切力的區(qū)域，從而將細(xì)胞與基質(zhì)分離開，使其適用于單細(xì)胞分析。美天旎也提供gentleMACS組織處理器及各類組織解離
試劑盒，能夠高效、穩(wěn)定地處理各類樣本，獲得高活力的單細(xì)胞懸液。
哪種方法更好：細(xì)胞還是細(xì)胞核？
人們不禁會(huì)問(wèn)，細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組是否代表了整個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，以及在snRNA-seq中發(fā)現(xiàn)的基因是否或多或少與特定研究相關(guān)。一些比較單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）和單核RNA測(cè)序的研究表明，轉(zhuǎn)錄本在整個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞核中的表達(dá)程度相當(dāng)。
華盛頓大學(xué)（圣路易斯）的一個(gè)研究小組*近將單細(xì)胞測(cè)序（DropSeq）與單細(xì)胞核測(cè)序（sNuc-DropSeq）進(jìn)行比較。他們研究的對(duì)象是纖維化成年小鼠腎臟。通過(guò)分析DropSeq獲得的11,000個(gè)轉(zhuǎn)錄組，研究人員發(fā)現(xiàn)腎小球細(xì)胞不存在，并且另一組細(xì)胞似乎經(jīng)歷了解離誘導(dǎo)的應(yīng)激。相比之下，單核RNA測(cè)序揭示了腎細(xì)胞的完整多樣性。
這些研究人員的結(jié)論是，盡管在細(xì)胞類型覆蓋度方面具有可比性，但單核RNA測(cè)序的優(yōu)勢(shì)在于“減少了解離偏倚，與冷凍樣品兼容，避免了解離引起的轉(zhuǎn)錄應(yīng)激反應(yīng)以及在纖維化腎臟上有著出色的表現(xiàn)”。
單核RNA測(cè)序技術(shù)
2017年，Broad研究所張鋒和Aviv Regev領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)開發(fā)出一種名為DroNc-Seq的單細(xì)胞核測(cè)序方法。它受到Drop-Seq方法的啟發(fā)，融合sNuc-Seq和微流體技術(shù)，能夠?qū)Υ竽X等復(fù)雜組織進(jìn)行大規(guī)模的并行分析。
DroNc-Seq方法消除了解離偏倚的問(wèn)題，適用于固定組織或不容易解離的細(xì)胞。同時(shí)，與sNuc-Seq相比，它的實(shí)驗(yàn)規(guī)模大大擴(kuò)大，可加速表達(dá)譜分析，并降低實(shí)驗(yàn)成本。在此基礎(chǔ)上，Dolomite Bio公司開發(fā)出了Nadia高通量單細(xì)胞建庫(kù)儀。
此外，加州大學(xué)圣地亞哥分校的張鹍教授團(tuán)隊(duì)也在2017年開發(fā)出基于微流體的單核RNA測(cè)序技術(shù)——snDrop-seq。這種技術(shù)攻克了在微滴中有效裂解核膜而不引起RNA過(guò)度降解的難題，可以對(duì)成千上萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，還可用來(lái)評(píng)估新鮮和凍存組織的特異性表達(dá)譜，有助于研究組織的功能異質(zhì)性。
單核RNA測(cè)序通過(guò)揭示復(fù)雜腫瘤的細(xì)胞類型、狀態(tài)、遺傳多樣性和相互作用，拓寬了單細(xì)胞研究的能力，特別是長(zhǎng)期保存或冷凍保存的樣品。它克服了解離偏倚的問(wèn)題，也適用于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的組織。不過(guò)，細(xì)胞核的mRNA含量要低得多，而細(xì)胞核與細(xì)胞RNA表達(dá)是否重疊，這也是研究機(jī)構(gòu)一直在解決的問(wèn)題。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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