一、原理
LoWry法是雙縮脲法（Biuret）和福林酚法（Folin-酚）的結(jié)合與發(fā)展。其原理是
蛋白質(zhì)
溶液用堿性銅溶液處理后，堿性銅試劑與蛋白質(zhì)中的肽鍵作用產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)，形成銅—蛋白質(zhì)的絡(luò)合鹽。再加入酚試劑后，在堿性條件下，這種被作用的蛋白質(zhì)上的酚類基團極不穩(wěn)定，很容易還原酚試劑中的磷鎢酸和磷鉬酸，使之生成磷鎢藍和磷鉬藍的混合物。這種溶液藍色的深淺與蛋白的含量成正相關(guān)，所以可以用于蛋白質(zhì)含量的測定。
LoWry法除使肽鏈中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等顯色外，還使雙縮脲法中肽鍵的顯色效果更強烈，其顯色效果比單獨使用酚試劑強3-15倍，約是雙縮脲法的100倍。由于肽鍵顯色效果增強，從而減少了因蛋白質(zhì)種類不同引起的偏差。LoWry法適于微量蛋白的測定，對多個樣品同時測定較為方便。但對不溶性蛋白和膜結(jié)合蛋白必須進行預處理（如加入少量的SDS）。
1.雙縮脲法的原理雙縮脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）在堿性溶液中可與銅離子產(chǎn)生紫紅色的絡(luò)合物，這一反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。因為蛋白質(zhì)中有多個肽鍵，也能與銅離子發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，且顏色深淺與蛋白質(zhì)的含量的關(guān)系在一定范圍內(nèi)符合比爾定律，而與蛋白質(zhì)的氨基酸組成及分子量無關(guān)，所以可用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)的含量。
雙縮脲反應(yīng)主要涉及肽鍵，因此受蛋白質(zhì)特異性影響較小。且使用試劑價廉易得，操作簡便，可測定的范圍為1-10mg蛋白質(zhì)，適于精度要求不太高的蛋白質(zhì)含量的測定，能測出的蛋白質(zhì)含量須在約0.5mg以上。雙縮脲法的缺點是靈敏度差、所需樣品量大。干擾此測定的物質(zhì)包括在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖液，如Tris緩沖液，因為它們產(chǎn)生陽性呈色反應(yīng)，銅離子也容易被還原，有時出現(xiàn)紅色沉淀。
2.福林-酚法的原理
該方法是雙縮脲法的發(fā)展，包括兩步反應(yīng)：
（1）在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)—銅絡(luò)合物。
（2）此絡(luò)合物將試劑磷鉬酸—磷鎢酸（Folin試劑）還原，混合物深藍色（磷鉬藍和磷鎢藍混合物），顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此方法操作簡便，靈敏度比雙縮脲法高100倍，定量范圍為5-100μg蛋白質(zhì)。Folin試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物，均有干擾作用。此方法的缺點是有蛋白質(zhì)的特異性影響，即不同蛋白質(zhì)因絡(luò)氨酸、色氨酸含量的不同而使顯色強度稍有不同，標準曲線也不是嚴格的直線形式。
二、
儀器與用具
試管若干；刻度移液管0.5ml 1支，1ml 1支，10ml 1支；定量加樣器；圓底燒瓶；冷凝管1套（帶橡膠管）；微量滴定管；小燒杯；微量進樣器50μl 1支；721分光光度計；恒溫水浴器；研缽；玻棒；
離心機；離心管。
三、試劑
Na2WO4·2H2O；Na2MoO4·2H2O；85%H3PO4；濃HCl；Li2SO4·H2O；溴水；酚酞指示劑；Na2CO3；NaOH；CuSO4·5H2O；酒石酸鉀鈉；
牛血清白蛋白。
四、方法
1.試劑的配制
（1）堿性銅試劑（相當于雙縮脲試劑）的制備
首先配制A液：4%碳酸鈉（Na2CO3）溶液與0.2mol/L氫氧化鈉（NaOH）溶液等比例混合（2%Na2CO3，0.1mol NaOH）；B液：1%硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶液與2%酒石酸鉀鈉溶液等比例混合（0.5%CuSO4·5H2O，0.1%酒石酸鉀鈉）。在使用前將A液與B液按50∶1的比例混合即成。此為FolIn－酚試劑甲液，此試劑只能使用1天。
酚試劑（相當于Folin試劑）的配備：稱取鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）100g、鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）25g，加蒸餾水700ml溶解于1500Ml的圓底燒瓶中。之后加入85%的H3PO450ml，濃HCl 100ml，安上回流裝置（使用磨口接頭，若用軟木塞或橡皮塞時，就必須用錫鉑紙包起來），使其慢慢沸騰10H。冷卻后加入硫酸鋰（Li2SO4·H2O）150g，水50ml，溴水2~3滴，不用回流裝置開口煮沸15min，以釋放出過量的溴。待冷卻后稀釋至1000ml，并過濾入棕色瓶中，密閉于冰箱中保存（冷卻后溶液呈黃色，倘若仍呈綠色，須再滴加數(shù)滴液體溴，繼續(xù)煮沸15min）。使用時用標準NaOH溶液滴定，以酚酞作為指示劑，滴定終點由藍變灰，滴定后算出酸的濃度。使用時大約加水1倍，使*終濃度相當于1mol/L H+酸，此為Folin-酚試劑乙液（Folin試劑）。
在測定時要注意，因為酚試劑僅在酸性條件下穩(wěn)定，但此實驗的反應(yīng)只在PH值為10的情況下發(fā)生，所以當加酚試劑時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞前即能發(fā)生還原反應(yīng)，否則會使顯色程度減弱。
（2）標準蛋白質(zhì)溶液的配制 稱取25mg牛血清白蛋白，溶于100ml蒸餾水中，使*終濃度為250μg/ml。
原創(chuàng)作者：上海遠慕生物科技有限公司
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