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2014年，人類蛋白質(zhì)組草圖繪制完成，這是繼人類基因組計(jì)劃之后第二個(gè)生命科學(xué)的里程碑，為人們深入了解疾病狀態(tài)下的機(jī)體變化奠定了基礎(chǔ)。中國人類蛋白質(zhì)組計(jì)劃近兩年也陸續(xù)公布了階段的成果，有望揭示腫瘤的分子機(jī)制和治療靶點(diǎn)，推動(dòng)了精準(zhǔn)醫(yī)療的新浪潮。

質(zhì)譜（Mass Spectrometry, MS）已成為蛋白質(zhì)檢測(cè)和鑒定的方法。質(zhì)譜儀的準(zhǔn)確性、靈敏度和靈活性實(shí)現(xiàn)了生物研究、生物制藥和診斷檢測(cè)方面的新應(yīng)用。不過，由于蛋白質(zhì)組非常復(fù)雜，制備質(zhì)譜分析所用的蛋白質(zhì)樣品尚無標(biāo)準(zhǔn)方法。那么，在樣品處理時(shí)需要注意什么呢？

明確樣品類型

針對(duì)不同類型的樣品，比如細(xì)胞、組織、體液（包括血清、血漿、尿液和腦脊液等），前處理方法是不同的。在設(shè)計(jì)具體的樣品制備策略時(shí)，我們應(yīng)當(dāng)考慮多個(gè)因素，包括樣品類型、蛋白質(zhì)的各種性質(zhì)以及它在細(xì)胞中的定位。針對(duì)這些因素進(jìn)行優(yōu)化，才能產(chǎn)生靈敏而可靠的結(jié)果。

需要注意的是，蛋白質(zhì)往往以不同的量存在，而高豐度蛋白會(huì)掩蓋低豐度蛋白的信號(hào)。血液樣品中就含有大量干擾的高豐度蛋白（比如血清白蛋白和免疫球蛋白），影響了生物標(biāo)志物的檢測(cè)。

傳統(tǒng)切膠去除法操作麻煩、效率極低且重復(fù)性很差，逐漸被淘汰。利用色譜柱和液相去除的方法雖然效果還可以，但時(shí)間冗長，很難實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品同時(shí)操作。近年來基于離心柱形式的高豐度蛋白去除試劑盒越來越受歡迎。遠(yuǎn)慕生物也提供了以下三種產(chǎn)品。

樣品處理方法

質(zhì)譜分析前的樣品處理是一個(gè)復(fù)雜的過程。在富集目標(biāo)蛋白或研究蛋白定位時(shí)，可能需要行亞細(xì)胞蛋白組分分離。之后可采用基于蛋白序列、抗體表位、翻譯后修飾（PTM）或活性位點(diǎn)結(jié)合等多種不同的技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行富集。這是分離低豐度蛋白或降低樣品復(fù)雜度的必經(jīng)步驟。

之后還要進(jìn)行變性、還原、烷基化、除鹽、純化、再除鹽等一系列冗長的步驟，不過目前市場上也有商品化的快速處理試劑盒，能夠?qū)⑻幚頃r(shí)間從2天*快縮短到3小時(shí)。比如，遠(yuǎn)慕生物的EasyPep Mini MS樣品制備試劑盒利用預(yù)先配制的緩沖液、質(zhì)譜級(jí)的酶混合物以及多肽純化柱來處理哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織，不到3小時(shí)就可以生成與質(zhì)譜兼容的多肽樣品。

圖1. 傳統(tǒng)方法與優(yōu)化試劑盒的對(duì)比

多肽定量

正如western blot電泳之前對(duì)蛋白裂解液進(jìn)行定量一樣，質(zhì)譜上機(jī)前也必須對(duì)酶解后的多肽進(jìn)行定量，以便優(yōu)化蛋白樣品/蛋白酶的比例。此外，串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)記（TMT）的上游也建議要測(cè)定蛋白/肽段的濃度，以確保在混合之前用于標(biāo)記的樣品是完全等量的。

由于大多數(shù)的蛋白定量方法在檢測(cè)酶解后的肽濃度時(shí)不夠靈敏，推薦使用易用型的Pierce比色法或熒光法肽段定量試劑盒進(jìn)行肽段濃度測(cè)定，這兩款試劑盒是專為提高肽段混合物定量的靈敏度和重復(fù)性而設(shè)計(jì)的。顯色法肽段定量試劑盒 可以兼容后續(xù)的TMT定量。熒光法肽段定量試劑盒 一般不能兼容后續(xù)的TMT定量。

多肽標(biāo)記

根據(jù)樣品類型和是否需要標(biāo)記，一般有如下幾種標(biāo)記選擇。串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)記（TMT）和代謝氨基酸標(biāo)記（SILAC）可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品的質(zhì)譜分析，增加樣品通量，對(duì)來自細(xì)胞、組織或體液的2-10個(gè)不同樣品進(jìn)行相對(duì)定量。TMT因?yàn)槠淠軐?shí)現(xiàn)多至11標(biāo)的高通量，且定量穩(wěn)定，所以成為目前市面上*常用的定量蛋白組學(xué)方法。

多肽富集和組分分離

低豐度蛋白的成功分析和磷酸化肽段的鑒定往往離不開這幾步：富集、分離和/或純化。在細(xì)胞裂解液中，許多磷酸化肽段以極低的水平存在。您可以根據(jù)研究方向選擇富集方式，如果要富集磷酸化肽段，基于Fe-NTA 和 TiO2的方法是主流，一般用富集率和鑒定率來衡量質(zhì)量。

研究人員曾用遠(yuǎn)慕High-Select™ Fe-NTA磷酸化肽段富集試劑盒對(duì)3份293T 細(xì)胞裂解液進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，三次重復(fù)的磷酸化肽段富集效率均在高達(dá)97%以上，且共鑒定出10,898條多肽信息，鑒定率均在50%以上。

由于每種配體的結(jié)合性質(zhì)不同，如果將Fe-NTA 和 TiO2的方法連用，可以實(shí)現(xiàn)磷酸化多肽的富集效率和覆蓋度。

對(duì)于組分分離，除了傳統(tǒng)的液相系統(tǒng)外，您還可以采用離心柱形式的高pH反相多肽離心柱。Pierce高pH反相多肽分離試劑盒包含高pH值的溶液（0.1%三乙胺）和12支離心柱，結(jié)合離心機(jī)使用只需1小時(shí)即可完成分離，且可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品的高通量操作。

多肽脫鹽純化

上機(jī)前的*后一步就是要保證多肽經(jīng)過脫鹽純化，脫鹽不充分不僅會(huì)影響目的肽段的鑒定，而且容易損壞儀器。此時(shí)可使用反相（RP）樹脂來去除鹽和緩沖液，其中C18基質(zhì)是用于捕獲疏水肽的理想基質(zhì)。多肽在高水相流動(dòng)相中與反相柱結(jié)合，同時(shí)鹽和緩沖液被洗去，然后用高有機(jī)相流動(dòng)相洗脫多肽。Pierce™ C18系列不僅提供了適合大體積樣本的離心柱（column），還提供了適合小體積樣本的吸頭（tip）。

總而言之，質(zhì)譜上機(jī)前的樣品制備流程環(huán)環(huán)相扣，每一步若質(zhì)量不達(dá)標(biāo)都會(huì)影響整體檢測(cè)結(jié)果。為了幫助科研工作者從復(fù)雜的流程中解放出來，遠(yuǎn)慕致力于研發(fā)和拓展質(zhì)譜兼容的產(chǎn)品和技術(shù)，為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供整體解決方案。

原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司