Western Blot已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室中檢測(cè)
蛋白質(zhì)的常規(guī)手段。不過想要得到一張條帶清晰、沒有雜帶、背景干凈的圖片，還是具有一定挑戰(zhàn)性的。我們?cè)谧龅鞍纂娪竞蚖estern Blot時(shí)，多數(shù)都用的Bio-Rad公司的
儀器，所以Bio-Rad蛋白方面的技術(shù)專家的確可以稱之為專家，因?yàn)槊刻於加泻芏嗳讼蛩麄冋?qǐng)教。他們就將*常見的問題整理成《Western Blotting Troubleshooter》。我們節(jié)選了一部分，希望能幫你節(jié)省一些查資料的時(shí)間。
Q：我的結(jié)果是膜上一片空白。為什么會(huì)這樣？
A：導(dǎo)致這種結(jié)果的因素很多。
膠和膜放反了 如果在轉(zhuǎn)印的過程中，膠和膜的位置顛倒了，那么蛋白就從膠上轉(zhuǎn)移到緩沖液中，而不會(huì)到達(dá)膜上。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)印，凝膠應(yīng)靠近三明治的負(fù)極，而膜對(duì)應(yīng)正極。
轉(zhuǎn)膜效率低 轉(zhuǎn)膜效率受多種因素影響，包括蛋白的大小、凝膠中丙烯酰胺的百分比、電場(chǎng)強(qiáng)度、轉(zhuǎn)印時(shí)間和緩沖液的pH值。一般說來(lái)，蛋白越大，轉(zhuǎn)移得越慢。轉(zhuǎn)移大蛋白的方法是用高的電場(chǎng)強(qiáng)度。而小蛋白長(zhǎng)時(shí)間處于高電場(chǎng)強(qiáng)度下可能會(huì)穿出轉(zhuǎn)印膜。避免這個(gè)問題的方法是用0.2 um孔徑的NC膜或PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)印。如果蛋白的等電點(diǎn)接近緩沖液的pH值，那么這個(gè)蛋白攜帶的電荷很少，在電場(chǎng)中也幾乎不移動(dòng)。如果你的目的蛋白是強(qiáng)堿性的，那么你可以用碳酸鹽（pH9.9）、CAPS（pH11）及酸性緩沖液。
在轉(zhuǎn)印之后，你可以通過染膠或第二塊膜來(lái)判斷轉(zhuǎn)印效率。為了幫助你直接監(jiān)控轉(zhuǎn)印效率，Bio-Rad也提供了多種預(yù)染Marker，它們?cè)陔娪疽约稗D(zhuǎn)膜之后可直接觀察到。
試劑放置太久或存放條件不正確
抗體會(huì)慢慢降解，如果反復(fù)凍融的話，它會(huì)快速降解。底物應(yīng)儲(chǔ)存在-20°C。
抗體不純或滴度太低 一抗的濃度差異很大，應(yīng)該根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)決定一抗的稀釋度。過猶不及，太多的抗體也會(huì)阻礙抗原與抗體的結(jié)合。一般的原則是以1:100-1:1000來(lái)稀釋血清或組織培養(yǎng)上清，以1:1000-1:10000來(lái)稀釋腹水或超免疫動(dòng)物的血清。Bio-Rad的印跡級(jí)別的二抗稀釋度是1:3000。
酶失活了 疊氮鈉是辣根過氧化物酶的抑制劑。不要在HRP顯色的western blot中使用任何含疊氮鈉的試劑。疊氮鈉可以用于堿性磷酸酶結(jié)合的抗體中，而無(wú)副作用。另外，自來(lái)水或用聚苯乙烯樹脂去離子的水也可能會(huì)使酶失活，只能使用蒸餾的去離子水。
使用Tween-20洗滌 Tween-20（吐溫-20）可能會(huì)干擾某些抗體-抗體相互作用，或洗走NC膜上的目的蛋白。盡管在洗滌時(shí)它的終濃度只有0.05%-0.1%，但仍可能會(huì)影響結(jié)合。因此除了封閉之后的次洗滌，其他洗滌過程中都不使用Tween-20，不過，這可能會(huì)使背景升高。
檢測(cè)系統(tǒng)缺乏足夠的靈敏度 確保蛋白的上樣量在檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度范圍內(nèi)：
辣根過氧化物酶 500 pg/band
堿性磷酸酶 100 pg/band
增強(qiáng)的堿性磷酸酶 5 pg/band
膠體金 100 pg/band
增強(qiáng)的膠體金 10 pg/band
Immun-Star 化學(xué)發(fā)光 10 pg/band
Q：我的western blot總是背景過高，如何解決？
A：背景過高可能是由很多因素引起的：封閉不完全、顯色過度、洗滌不充分、轉(zhuǎn)移緩沖液或設(shè)備有污染、抗體稀釋度不對(duì)或抗體不純。
封閉不完全 一抗或二抗只要結(jié)合到膜上，就會(huì)顯色。為了避免非特異性的結(jié)合，應(yīng)用封閉液孵育膜，使所有的空白位點(diǎn)都被封閉蛋白占有。NC膜推薦的封閉液是3%的明膠。在室溫孵育1小時(shí)。明膠不能在4℃孵育，因?yàn)樗鼤?huì)凝結(jié)。如果想要低溫封閉的話，可以用3%的BSA。PVDF膜推薦的封閉液是5%的脫脂奶粉。脫脂奶粉不能與Bio-Rad生物素化的蛋白標(biāo)準(zhǔn)一起使用。脫脂奶粉濃度過高也可能會(huì)產(chǎn)生背景。
顯色過度 顯色時(shí)間的長(zhǎng)短取決于蛋白條帶的數(shù)目以及你想要的靈敏度。如果膜在顯色液中放置太久，背景就會(huì)偏高。應(yīng)當(dāng)在蛋白條帶清晰可見，而背景幾乎沒有或很少時(shí)，將膜及時(shí)取出。
洗滌不充分 在封閉以及抗體孵育之后，至少要洗兩次膜，每次5分鐘。去污劑的濃度不要太高，否則會(huì)把抗原從膜上洗下來(lái)。
轉(zhuǎn)移緩沖液或設(shè)備污染 使用清潔劑將轉(zhuǎn)印槽內(nèi)外徹底清洗干凈。海綿墊也一定要認(rèn)真清洗。臟的海綿墊通常是污染的*主要原因。另外，每次轉(zhuǎn)膜時(shí)的緩沖液都要是新鮮配制的。
抗體稀釋度不正確 一抗的稀釋度應(yīng)根據(jù)抗體來(lái)源和經(jīng)驗(yàn)來(lái)決定。一般來(lái)說，以1:100-1:1000來(lái)稀釋血清或組織培養(yǎng)上清，以1:1000-1:10000來(lái)稀釋腹水或超免疫動(dòng)物的血清。Bio-Rad的印跡級(jí)別的二抗稀釋度是1:3000�？贵w稀釋度不夠，會(huì)產(chǎn)生非特異的結(jié)合，帶來(lái)高背景。
二抗不純 沒有交叉吸附過的二抗可能會(huì)與膜上的其他蛋白相互作用，產(chǎn)生雜帶。
Q：在轉(zhuǎn)膜的過程中，緩沖液總是很熱，我該怎么辦？
A：如果緩沖液過熱，它就會(huì)分解，產(chǎn)生更多的熱量。這可是一個(gè)大問題。為了避免分解，一定要確保你的冷卻設(shè)備沒問題，使用的是推薦的緩沖液，而且不在過高的功率下轉(zhuǎn)印。
足夠的冷卻條件 在大部分情況下，都應(yīng)當(dāng)使用循環(huán)冷卻水來(lái)進(jìn)行冷卻。在冷庫(kù)中轉(zhuǎn)印，或?qū)⑥D(zhuǎn)印槽放置在冰浴中都是不行的。因?yàn)榇蟛糠洲D(zhuǎn)印槽都是塑料做的，不能有效地散熱。另外，由于膠附近的緩沖液通常是靜止的，在轉(zhuǎn)印過程中應(yīng)攪動(dòng)來(lái)維持循環(huán)。
緩沖液 轉(zhuǎn)印緩沖液的離子濃度必須是已知的，來(lái)防止過熱。如果離子濃度過高，電壓就應(yīng)該降低（恒流轉(zhuǎn)印），如果是恒壓轉(zhuǎn)印的話，就會(huì)過熱。
功率條件 轉(zhuǎn)印過程中產(chǎn)生的熱是與功率成正比的。我們都知道，功率是電壓與電流的乘積。P="IE" 而電壓、電流和電阻又滿足這個(gè)等式：R="V/I。當(dāng)緩沖液分解時(shí)，電阻下降。如果電壓是恒定的，則電流上升。因此，功率上升，產(chǎn)生更多的熱量。如果電流是恒定的，則電壓和功率下降，使蛋白轉(zhuǎn)移得更慢。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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