轉(zhuǎn)染是個(gè)坎，讓我教你怎么翻過(guò)去遠(yuǎn)慕新聞√_技術(shù)文章

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轉(zhuǎn)染是個(gè)坎，讓我教你怎么翻過(guò)去遠(yuǎn)慕新聞√
閱讀次數(shù)：907 發(fā)布時(shí)間：2019/8/26 10:29:54

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從基因表達(dá)到RNA干擾，再到如今大熱的基因組編輯，它們都離不開(kāi)一個(gè)前提：DNA或RNA分子能夠高效地導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)并發(fā)揮功能。然而，問(wèn)題是，細(xì)胞并不想接收它們，而細(xì)胞膜也是一個(gè)可怕的屏障，它帶的是負(fù)電荷，核酸同樣帶負(fù)電荷。

不過(guò)，人類(lèi)的智慧是無(wú)限的。人們已經(jīng)設(shè)計(jì)出各種方法來(lái)繞過(guò)這一屏障，包括化學(xué)方法，利用帶正電的轉(zhuǎn)染試劑來(lái)中和帶負(fù)電的核酸；生物學(xué)方法，采用經(jīng)過(guò)遺傳學(xué)改造的病毒將非病毒基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)；以及物理方法，在細(xì)胞膜上開(kāi)孔，將核酸直接送入細(xì)胞。

當(dāng)然，各種細(xì)胞適用的轉(zhuǎn)染條件都可能不同，正所謂甲之蜜糖、乙之砒霜，并沒(méi)有一種放之四海而皆準(zhǔn)的方法。因此，研究人員需要根據(jù)你的細(xì)胞類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)要求來(lái)選擇理想的方法。何謂理想的方法？那就是轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低、對(duì)正常生理的影響*小，并且簡(jiǎn)單可重復(fù)。這看似挺難，好在Thermo Fisher（原Life Technologies）帶來(lái)了一個(gè)轉(zhuǎn)染的整體解決方案，可幫助你快速實(shí)現(xiàn)目標(biāo)。

既高效又溫和的DNA轉(zhuǎn)染——Lipofectamine™ 3000

對(duì)于DNA的轉(zhuǎn)染，大家往往在時(shí)間想到Lipofectamine™ 2000。這種金招牌的陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑幾乎是人們的，目前引用文獻(xiàn)已經(jīng)超過(guò)50,000篇。通過(guò)帶負(fù)電荷的核酸與帶正電荷的合成脂質(zhì)體試劑之間的靜電作用，核酸-陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑復(fù)合物自發(fā)形成。細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞作用攝取復(fù)合物，然后釋放至胞漿。一旦進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)染DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，通過(guò)未知的機(jī)制表達(dá)。

之所以如此受歡迎，首先是因?yàn)樗軌蚋咝мD(zhuǎn)染各種細(xì)胞系，幫助在各種實(shí)驗(yàn)的步獲得漂亮的結(jié)果，其次也因?yàn)樗鼘?duì)DNA和RNA皆有效，適合DNA和RNA的共轉(zhuǎn)染。不過(guò)，轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性，正如硬幣的正反兩面。Lipofectamine 2000在獲得贊揚(yáng)聲的同時(shí)，也收到毒性高的詬病。對(duì)于頑強(qiáng)的細(xì)胞系而言，這可能不是問(wèn)題，但是嬌弱的原代細(xì)胞和干細(xì)胞卻折騰不起。

為此，Thermo Fisher的科學(xué)家優(yōu)化了轉(zhuǎn)染過(guò)程的四個(gè)步驟，并結(jié)合的脂質(zhì)體納米微粒技術(shù)，開(kāi)發(fā)出*新的Lipofectamine 3000試劑。它提供了出眾的轉(zhuǎn)染性能和可重復(fù)的結(jié)果，適用于各種難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和常見(jiàn)的細(xì)胞。由于轉(zhuǎn)染性能出眾，你在轉(zhuǎn)染過(guò)程中可減少試劑的用量，從而進(jìn)一步降低潛在的毒性風(fēng)險(xiǎn)。

3000與2000相比，轉(zhuǎn)染效率如何？研究人員當(dāng)然也進(jìn)行了比較。他們使用這兩種試劑轉(zhuǎn)染來(lái)自各種組織的癌細(xì)胞。研究證實(shí)，Lipofectamine 3000試劑的轉(zhuǎn)染性能明顯高于2000。使用Lipofectamine 2000時(shí)，只有25%的癌癥細(xì)胞系被認(rèn)為是容易轉(zhuǎn)染的（轉(zhuǎn)染效率高于50%），而使用Lipofectamine 3000，這個(gè)比例高達(dá)60%。里斯本大學(xué)的Rui Eduardo Castro博士在使用過(guò)Lipofectamine 3000后興奮地說(shuō)道：“我們非常高興且驚訝地看到，在難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中使用Lipofectamine 3000，可將轉(zhuǎn)染效率提高10倍，而且減少了細(xì)胞死亡率。結(jié)果真是太棒了！”

因此，即使是難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，使用Lipofectamine 3000也很容易獲得滿意的結(jié)果。還是有點(diǎn)不滿意？沒(méi)關(guān)系，Thermo Fisher建議你嘗試一下不同的DNA濃度和細(xì)胞密度。采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時(shí)貼壁細(xì)胞達(dá)到70-90%匯合，懸浮細(xì)胞達(dá)5 x 10⁵至2 x 10⁶個(gè)細(xì)胞/mL，可以獲得*佳的結(jié)果。還是不行？那就試試mRNA轉(zhuǎn)染吧。

mRNA也能高效轉(zhuǎn)染？當(dāng)然！——Lipofectamine™ MessengerMAX™

關(guān)于mRNA轉(zhuǎn)染，人們往往有多種誤解。有人認(rèn)為，mRNA難以制備。其實(shí)，這方面的工具有很多，比如Thermo Fisher的mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra轉(zhuǎn)錄試劑盒，就能制備20-40 ¬μg即用型mRNA。還有人認(rèn)為，mRNA不穩(wěn)定，容易降解。No，no！只要采取一些簡(jiǎn)單的預(yù)防措施，就能確保mRNA穩(wěn)定：使用不含RNA酶的試劑和吸頭，分裝mRNA并置于-80ºC保存。

與DNA轉(zhuǎn)染相比，mRNA轉(zhuǎn)染只需進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，而非細(xì)胞核，從而大大提高了有絲分裂后細(xì)胞或緩慢分裂細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。這樣，利用Lipofectamine MessengerMAX轉(zhuǎn)染mRNA可以實(shí)現(xiàn)更快速的蛋白質(zhì)表達(dá)，在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中達(dá)到更高的表達(dá)一致性，特別適合原代神經(jīng)元、神經(jīng)干細(xì)胞和永生化神經(jīng)細(xì)胞。

在基因組編輯的應(yīng)用中，Lipofectamine MessengerMAX試劑通過(guò)高效轉(zhuǎn)染提高了GeneArt™ CRISPR核酸酶mRNA的剪切和重組效率，可以大大提高基因修飾的效率并簡(jiǎn)化下游過(guò)程。此外，mRNA不會(huì)入核，這下老板再也不用擔(dān)心基因組整合的風(fēng)險(xiǎn)了。

也許你會(huì)擔(dān)心，操作起來(lái)一定很復(fù)雜吧。其實(shí)，只要制備好了mRNA，轉(zhuǎn)染的基本步驟與DNA相同，不外乎是稀釋、孵育這些，難不倒諸位高手。況且還可以購(gòu)買(mǎi)陽(yáng)性對(duì)照GFP mRNA同時(shí)轉(zhuǎn)一下，效果好不好，一看就知道。

CRISPR好幫手——Lipofectamine™ CRISPRMAX™ Cas9轉(zhuǎn)染試劑

對(duì)于基因組編輯，有些人使用CRISPR質(zhì)粒，有些人使用Cas9 mRNA。其實(shí)，使用Cas9蛋白可在原代細(xì)胞和干細(xì)胞中獲得出色的切割效率。它避免了轉(zhuǎn)錄或翻譯，可立即發(fā)揮作用，快速去除，程度地降低了脫靶剪切的幾率。GeneArt™ Platinum™ Cas9核酸酶就是這樣一種野生型的Cas9蛋白。

也許你要問(wèn)，如何將Cas9蛋白導(dǎo)入細(xì)胞呢？那就要依靠Lipofectamine™ CRISPRMAX™ Cas9轉(zhuǎn)染試劑了。這是款為CRISPR-Cas9蛋白轉(zhuǎn)染而優(yōu)化的脂質(zhì)體納米微粒轉(zhuǎn)染試劑。這款試劑簡(jiǎn)單易用，高效低毒，如今已在iPSC、mESC、CHO等20多種細(xì)胞上進(jìn)行了檢驗(yàn)。與電穿孔相比，它更為溫和，因此所需的細(xì)胞較少，每個(gè)反應(yīng)的成本較低。此外，它也能輕松擴(kuò)展到高通量實(shí)驗(yàn)，是CRISPR實(shí)驗(yàn)的好幫手。

RNAi的不二之選——Lipofectamine™ RNAiMAX

RNAi作為基因功能研究的基本工具，如今已應(yīng)用在蛋白質(zhì)抑制研究、表型分析、通路分析和藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)上。小分子RNA（siRNA、miRNA）有其自身的特點(diǎn)，也就需要不一般的轉(zhuǎn)染試劑。

Lipofectamine™ RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑就是專門(mén)為小分子RNA而優(yōu)化的，可以高效地將小分子RNA導(dǎo)入廣泛的細(xì)胞系，包括常見(jiàn)的細(xì)胞類(lèi)型、干細(xì)胞、原代細(xì)胞以及難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

這種轉(zhuǎn)染試劑可以在10倍試劑濃度范圍內(nèi)獲得的干擾效果以及極佳的細(xì)胞存活率，這個(gè)特點(diǎn)使得Lipofectamine™ RNAiMAX的轉(zhuǎn)染條件極易優(yōu)化，以便在實(shí)驗(yàn)中使用的siRNA濃度，從而降低細(xì)胞毒性。盡管Lipofectamine™ RNAiMAX的說(shuō)明書(shū)建議以10 nM siRNA 作為優(yōu)化干擾效果的起始濃度，但是僅用1 nM siRNA 也可以獲得較好的干擾效果。

Lipofectamine™ RNAiMAX的操作也相當(dāng)簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)染后無(wú)需去除轉(zhuǎn)染復(fù)合物，無(wú)需更改或添加培養(yǎng)基。如果轉(zhuǎn)染的效果不理想，可以試試反向轉(zhuǎn)染，或改變siRNA用量，或轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度。另外，這款試劑只能用于小分子RNA的轉(zhuǎn)染，不能用于共轉(zhuǎn)染。如果需要共轉(zhuǎn)染，只能借助Lipofectamine 3000或2000。

體內(nèi)轉(zhuǎn)染不再是難題——Invivofectamine 3.0

眾所周知，原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染比傳代細(xì)胞要難得多，而體內(nèi)轉(zhuǎn)染又比體外轉(zhuǎn)染要難。對(duì)于這種高難度的實(shí)驗(yàn)，勉強(qiáng)使用傳統(tǒng)的體外轉(zhuǎn)染試劑（如脂質(zhì)體）是沒(méi)有幸福的，還是用專門(mén)的體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑，比如Thermo Fisher的Invivofectamine系列。一眨眼，Invivofectamine試劑已經(jīng)升級(jí)到第三代。

Invivofectamine 3.0試劑是一種無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分的脂質(zhì)納米顆粒，通過(guò)尾部靜脈注射，能夠?qū)iRNA和miRNA高效導(dǎo)入小鼠肝臟細(xì)胞。轉(zhuǎn)染效果如何？專家們做過(guò)實(shí)驗(yàn)，將Invivofectamine 3.0試劑與針對(duì)Factor VII或PPIB的siRNA混合，以每千克小鼠體重1 mg的注射量進(jìn)行靜脈注射，*終實(shí)現(xiàn)了高達(dá)85%的knockdown。與之前的產(chǎn)品相比，新試劑只需更少的siRNA，即可實(shí)現(xiàn)有效knockdown。此外，單次注射Invivofectamine 3.0試劑/siRNA復(fù)合物后，knockdown效果可維持長(zhǎng)達(dá)3周。想要靶向其它器官？賽默飛的科學(xué)家還進(jìn)行了胰腺和脾臟的實(shí)驗(yàn)，取得了很好的效果。

至于它的體內(nèi)毒性，專家們也曾評(píng)估過(guò)。他們?cè)谠噭┳⑸浜蟮亩鄠€(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行血液化學(xué)分析及細(xì)胞因子檢測(cè)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后每個(gè)個(gè)體的生物標(biāo)志物的水平與未注射該試劑的個(gè)體相比并沒(méi)有顯著差異。這表明復(fù)合物表現(xiàn)出極低的體內(nèi)毒性。這種試劑也相當(dāng)穩(wěn)定，即使反復(fù)凍融4次，也不會(huì)造成性能損失。

終極武器——Neon轉(zhuǎn)染系統(tǒng)

如果這些熱門(mén)工具都不管用，那我們只能祭出終極武器——Neon轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。這是Thermo Fisher第二代的臺(tái)式電穿孔設(shè)備，可將核酸（包括質(zhì)粒DNA和siRNA）高效導(dǎo)入幾乎任意一種動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，包括難以轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞、干細(xì)胞和造血系統(tǒng)來(lái)源的細(xì)胞，同時(shí)保持高的細(xì)胞活性。

與傳統(tǒng)的電穿孔儀不同，Neon系統(tǒng)并沒(méi)有傳說(shuō)中的電轉(zhuǎn)杯，而是用一個(gè)特殊的移液器吸頭取代。移液器吸頭內(nèi)使用24K鍍金電極，可形成更為均勻的電場(chǎng)，同時(shí)限度地減少溫度升高和pH值變化幅度，在確保細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染的同時(shí)，也更加溫和，保證細(xì)胞存活率更高。

Neon系統(tǒng)帶有兩種吸頭：10 μl和100 μl，讓你可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求靈活選擇，而不像傳統(tǒng)電穿孔儀那樣只能轉(zhuǎn)染固定量的細(xì)胞。使用Neon系統(tǒng)，每次*少可轉(zhuǎn)染2×10⁴個(gè)細(xì)胞，*多可轉(zhuǎn)染6×10⁶個(gè)細(xì)胞。當(dāng)然，這并非絕對(duì)。若你的細(xì)胞更少或更多，也可一試，據(jù)專家介紹，有一位用戶曾成功轉(zhuǎn)染了5000個(gè)原代毛囊細(xì)胞。

Neon也是一個(gè)開(kāi)放的系統(tǒng)，讓用戶能夠單獨(dú)控制每個(gè)參數(shù)。廠家也提供了一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，收集各種細(xì)胞類(lèi)型的建議設(shè)置，你可在這個(gè)基礎(chǔ)上優(yōu)化和調(diào)整。Neon能夠?qū)Χ喾N難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行高效轉(zhuǎn)染，包括原代星形膠質(zhì)細(xì)胞、原代樹(shù)突狀細(xì)胞、Jurkat、小鼠胚胎干細(xì)胞等。多種細(xì)胞類(lèi)型可獲得超過(guò)75%的轉(zhuǎn)染效率。