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ChIP是一種強(qiáng)大的確定蛋白或者組蛋白修飾在基因組上定位的實(shí)驗(yàn)方法。染色質(zhì)被分離出來后采用抗體與抗原的結(jié)合來判定目的蛋白是否結(jié)合在特定的DNA序列上或者判定目的蛋白結(jié)合位點(diǎn)在全基因組范圍的分布（微陣列或DNA序列）。這種方法具有空間性與時(shí)效性。該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為如何在細(xì)胞中進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)提供了詳細(xì)的步驟。

1. 交聯(lián)和細(xì)胞收獲

甲醛可以將蛋白質(zhì)交聯(lián)到DNA上。交聯(lián)結(jié)果的好壞決定于交聯(lián)時(shí)間的把握。我們建議樣品交聯(lián)的時(shí)間一般為2-30分鐘。過度的交聯(lián)會(huì)減少抗原的結(jié)合性和超聲斷裂的效率�？乖瓫Q定簇也會(huì)被掩蓋。加入甘氨酸可以消除甲醛使交聯(lián)反應(yīng)終止。

1.1.準(zhǔn)備兩個(gè)長(zhǎng)滿細(xì)胞的150cm2的細(xì)胞培養(yǎng)皿（1*107-5*107 個(gè)細(xì)胞/皿）。將甲醛直接滴入PBS洗過的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，使其終濃度為0.75%，然后在室溫緩慢旋轉(zhuǎn)10分鐘，使蛋白和DNA發(fā)生交聯(lián)。

1.2 加入甘氨酸使其終濃度為125mM,在室溫晃動(dòng)孵育5分鐘。

1.3 使用10ml預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞2次

1.4 使用細(xì)胞刮將細(xì)胞收獲放入 5ml 預(yù)冷PBS中，并轉(zhuǎn)入50ml的管子。

1.5.在皿里加入3mlPBS，將剩余的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50ml管子里1000g 離心5分鐘

1.6.將上清倒去，使用FA裂解液將沉淀重懸�。�1x107cells/750μl).

初始細(xì)胞要有1*107-5*107個(gè)，采用終濃度為0.75%甲醛和如上描述的甘氨酸處理。預(yù)冷PBS洗3次，1，000g離心5分鐘，沉淀用FA裂解液重懸浮。

2 超聲破碎

超聲裂解細(xì)胞懸液可以將DNA均一的打斷成500-1000bp的片段。不同的細(xì)胞系需要不同的超聲時(shí)間才能達(dá)到*優(yōu)效果。

交聯(lián)細(xì)胞要通過時(shí)間梯度的超聲來選擇*優(yōu)超聲條件。樣品通過時(shí)間梯度，DNA的分離如部分3所描述。片段大小序在1.5%的瓊脂糖凝膠上檢測(cè)分析。如圖一所示

圖一：

2.2 超聲破碎后，8000g，30秒，4°C,離心。將上清移入新的管子中。開始準(zhǔn)備進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀（IP）。

2.3 每份超聲樣品取50ul，這時(shí)的樣品標(biāo)記為INPUT，用于定量DNA濃度和作為PCR的空白對(duì)照。

超聲后的染色質(zhì)應(yīng)立刻凍入液氮中或者儲(chǔ)存于-70°C可儲(chǔ)存2個(gè)月。避免多次反復(fù)凍融。

3檢測(cè)DNA濃度

1INPUT樣品用于為后來的IP樣品計(jì)算DNA濃度。DNA可采用PCR純化試劑盒（加入70ul洗脫液，接著進(jìn)入3.2a）或者采用酚/氯仿抽提（加入350ul洗脫液，接著按照3.2b進(jìn)行）2a.加入2ulRNaseA(0.5mg/ml).加熱至65°C搖晃4-5小時(shí)或者過夜以逆轉(zhuǎn)交聯(lián)。DNA采用PCR純化試劑盒中廠家說明進(jìn)行純化。樣品凍存于-20°C.

樣品之所以加入RnaseA是因?yàn)楦邼舛萊NA會(huì)在使用PCR純化試劑盒時(shí)干擾DNA的純化。而純化柱子的飽和度是既定的。

2b.加入5ul蛋白酶K(20mg/ml).加熱至65°C搖晃4-5小時(shí)或者過夜以逆轉(zhuǎn)交聯(lián)。采用酚/氯仿抽提的DNA使用乙醇沉淀于10ul的糖原(5mg/ml).中。100ul水重懸浮。樣品凍存于-20°C.

樣品采用蛋白酶K處理可使相鄰肽段剪切成羧基團(tuán)的芳香族氨基酸和脂肪族氨基酸。蛋白質(zhì)和DNA之間的交聯(lián)通過DNA的純化被打斷。

3檢測(cè)DNA濃度，取5ul純化的DNA到995ulTE中得到一個(gè)原溶液的200倍稀釋測(cè)其OD260。

那么DNA的濃度就為OD260x10,000.μg/ml。這樣就可計(jì)算出染色質(zhì)制品的DNA濃度。

4 免疫共沉淀

1 從2.2得來的染色質(zhì)制品，推薦每個(gè)IP樣品都采用25ug的DNA的量。每個(gè)樣品按1：10的量加入RIPA溶液。需要一個(gè)樣本作為空珠子的對(duì)照。

2在除空珠子對(duì)照樣品外每個(gè)樣品中加入一抗，抗體的量按照以往經(jīng)驗(yàn)來加，1-10ug的抗體/25ugDNA效果較好。

3加入20ul的proteinA/G珠子（預(yù)先用超聲處理成為單鏈的鯡精DNA和BSA吸附，詳見步驟4.3a）到所有樣品總，4°C搖轉(zhuǎn)IP過夜。

3a將蛋白A/G珠子與單鏈鯡精DNA進(jìn)行預(yù)處理。如果同時(shí)使用蛋白A珠子和蛋白G珠子，等體積混合這兩種珠子使用RIPA溶液洗3次。除去RIPA溶液，加入單鏈鯡精DNA到珠子終濃度為75ng/μl，再用BSA將珠子終濃度定到0.1μg/μl。加入兩倍珠子體積的RIPA溶液在室溫孵育30分鐘。用RIPA洗一次，然后加入同體積的RIPA。

蛋白A珠子，蛋白G珠子或者它們的混合都可以使用。表格1顯示了蛋白A和蛋白G珠子對(duì)于不同免疫球蛋白同型的親和力。



4. 2000g，1分鐘離心蛋白A/G珠子，移除上清

5用1ml的WashBuffer溶液清洗珠子3次，2，000g，1分鐘離心，移除上清6用1ml的FinalWashBuffer溶液清洗珠子1次，2，000g，1分鐘離心，移除上清如果觀察到背景很高可以增加清洗次數(shù)，另外，超聲處理后的染色質(zhì)也可以在步驟4.2以前采用蛋白A/G珠子孵育1小時(shí)。任何非特異吸附都可以通過這附加的一步清除掉。將上清（聲處理的染色質(zhì)）倒入一個(gè)新的管子中按照步驟4.2使用抗體和珠子。

5. 洗脫和逆轉(zhuǎn)交聯(lián)

1. 使用120ulElutionBuffer洗脫液加入蛋白A/G珠子中30°C搖晃15分鐘洗脫DNA。

2. 2000g，1分鐘離心，將上清移入新的管子中。此時(shí)的樣品可以凍存于-20°C3DNA可采用PCR純化試劑盒（步驟3.2a）或者酚/氯仿沉淀（加入280ul洗脫液，步驟見3.2b）4DNA的數(shù)量水平可通過定量PCR來檢測(cè)，引物和探針通�？梢允褂枚�量PCR儀上的軟件設(shè)計(jì)，或者使用在線設(shè)計(jì)軟件也可。

原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司