各位小伙伴，大家還記得當(dāng)初進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的時(shí)候接觸到的個(gè)實(shí)驗(yàn)技能是什么呢？沒(méi)錯(cuò)，是 PCR 擴(kuò)增。小編曾經(jīng)也是，看著自己親自配比 PCR 克隆擴(kuò)增的每個(gè)組分，親眼看著瓊脂糖凝膠在紫外透光臺(tái)上發(fā)出的幽綠色的熒光，也是深深被迷住。但總不可能成天就對(duì)著這個(gè)邪魅的熒光發(fā)呆，對(duì)吧？看久了，她會(huì)愛(ài)上你的眼睛，把你眼睛據(jù)為己有的，說(shuō)白了，就是眼睛看紫外看多了，瞎了。因此，小編也是不得不接著往下做著實(shí)驗(yàn)，從此也展開(kāi)了慢慢苦逼的生物科研道路。
今天小編要來(lái)分享的可不是 PCR 擴(kuò)增，相信在實(shí)驗(yàn)室摸爬滾打飽經(jīng)風(fēng)霜的小伙伴閉著眼睛都知道怎么做。小編今天要給大家分享的是我們的第二個(gè)實(shí)驗(yàn)技能。是的，你沒(méi)想錯(cuò)，就是分子克隆實(shí)驗(yàn)�？赡苓@時(shí)候?qū)嶒?yàn)室的老鳥(niǎo)會(huì)問(wèn)，小編你講分子克隆有什么意思啊，這個(gè)實(shí)驗(yàn)太基礎(chǔ)了，我閉著眼睛也會(huì)做，沒(méi)什么技術(shù)含量啊�？墒切【幭胝f(shuō)，分子克隆作為實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，相比于 NGS、Crisp9 這些高端實(shí)驗(yàn)確實(shí)簡(jiǎn)單，甚至比 Western blot、qPCR 這些基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)還要簡(jiǎn)單。但是，它作為大部分研究課題的實(shí)驗(yàn)開(kāi)展的基礎(chǔ)，甚至關(guān)系到整個(gè)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展與成敗。況且，這個(gè)簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)里面還有你不知道的秘密呢！要不，跟著小編一個(gè)一個(gè)來(lái)看看？
分子克隆實(shí)驗(yàn)原理：分子克隆指將我們的目的基因片段用體外重組的方式插入到克隆載體中，形成重組克隆載體。利用轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方式導(dǎo)入宿主
細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，利用宿主細(xì)胞對(duì)載體的復(fù)制和擴(kuò)增，從而獲得大量的目的片段拷貝。
分子克隆的實(shí)驗(yàn)流程： 
小編啊，這些我們都懂，哪是什么秘密呢？別急，小編只是怕你們實(shí)驗(yàn)做多了，有點(diǎn)兒忘了，給大家溫故一下。下面開(kāi)始敲黑板劃重點(diǎn)。
你不知道的限制性內(nèi)切酶：
1、保護(hù)堿基的選擇和添加和限制性內(nèi)切酶的用量限制性內(nèi)切酶是一種能夠識(shí)別特定核苷酸序列序列并在識(shí)別位點(diǎn)的固定位置進(jìn)行切割的一類酶，其切割后產(chǎn)物形成粘性末端或者平末端。廣泛用于分子克隆載體構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)。但我們別小看這個(gè)酶，她的脾氣還挺大的。小伙伴們有沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，大家有時(shí)候做實(shí)驗(yàn)，明明這段序列用特定的內(nèi)切酶切割過(guò)夜都不能夠切開(kāi)？這是為什么呢？因?yàn)槟恪稿X(qián)」沒(méi)給夠啊，不給錢(qián)，別人憑啥幫你辦事兒啊。什么是限制性內(nèi)切酶的「錢(qián)」呢？那我們不得不提到一個(gè)東西——保護(hù)堿基。我們都知道，在我們?cè)O(shè)計(jì)引物的時(shí)候，除了在引物的 5’添加限制性內(nèi)切酶以外，還需要額外添加 1-3 個(gè)堿基，這就是我們所說(shuō)的保護(hù)堿基。它的作用是能夠使得限制性內(nèi)切酶在識(shí)別了特定的核苷酸序列后能夠更好的附著在序列上對(duì)序列進(jìn)行切割，相當(dāng)于一個(gè)起到支撐作用的骨架。每個(gè)限制性酶都有對(duì)應(yīng)的保護(hù)堿基添加原則，并且保護(hù)堿基越多，對(duì)酶的穩(wěn)固作用越強(qiáng)，酶活性越好。這就是所謂的拿「錢(qián)」辦事兒，「錢(qián)」給夠了，事兒自然就辦好了。那我怎么知道這個(gè)保護(hù)堿基該如何添加呢？別急，小編已經(jīng)將不同限制性內(nèi)切酶保護(hù)堿基情況整理成表格放在文末了，各位有需要的小伙伴可以到文末查閱。
又有小伙伴問(wèn)，我保護(hù)堿基也添加了，酶切時(shí)間也足夠長(zhǎng)，為什么有時(shí)候還是不能夠?qū)?a target="_blank" title="質(zhì)粒" >
質(zhì)粒切開(kāi)呢？這里，小編悄悄告訴大家，其實(shí)有的時(shí)候也不是拿「錢(qián)」就一定能辦好事兒，遇到困難的事情，「錢(qián)」是解決不了的，需要靠眾人的力量。不同的質(zhì)�？赡艽嬖诙喾N復(fù)雜的高級(jí)結(jié)構(gòu)，像缺刻、超螺旋等。有的限制性內(nèi)切酶并不能夠完全應(yīng)對(duì)這些復(fù)雜的高級(jí)結(jié)構(gòu)，需要加大酶的使用量或者配合其他能夠適應(yīng)質(zhì)粒高級(jí)結(jié)構(gòu)的酶進(jìn)行雙酶切才能夠確保這些酶能夠完成切割。只是，對(duì)于應(yīng)對(duì)高級(jí)結(jié)構(gòu)不同的酶所需要添加的酶量，小編目前也還在進(jìn)行驗(yàn)證，到時(shí)候一定會(huì)將常見(jiàn)的酶種類分享給大家。
2、限制性內(nèi)切酶和質(zhì)粒的甲基化小編之前說(shuō)過(guò)，限制性內(nèi)切酶脾氣很大，遇到「不開(kāi)心的事兒」她就會(huì)罷工。同樣地，當(dāng)限制性內(nèi)切酶遇到了甲基化的質(zhì)粒，她也就這樣悄無(wú)聲息地罷工了，留下實(shí)驗(yàn)失敗的你獨(dú)自流淚。
甲基化是細(xì)菌用來(lái)保護(hù)自己的基因序列不被自身合成的限制性內(nèi)切酶所切割，是細(xì)菌的一種自我保護(hù)機(jī)制。常見(jiàn)的甲基化包括了 Dam+、Dcm+、EcoKI+、EcoBI+ 以及真核細(xì)胞中的 CpG 等。同理，不同的甲基化也能夠識(shí)別特定的序列，從而在特定的堿基上進(jìn)行。如果當(dāng)限制性內(nèi)切酶所識(shí)別的序列與甲基化識(shí)別的序列相同或者重疊時(shí)，限制性內(nèi)切酶將不能夠切開(kāi)該位點(diǎn)序列（見(jiàn)表二）。另外，還需注意一點(diǎn)，我們實(shí)驗(yàn)所采用的大腸桿菌是否是屬于上述甲基化的陽(yáng)性菌株，如果是，恭喜你，實(shí)驗(yàn)失敗很正常，懵逼樹(shù)下的懵逼果等你去嘗嘗。所以，快去看看文末你所用的限制性內(nèi)切酶是否和甲基化的識(shí)別序列重合，你的克隆菌株是否是甲基化的陽(yáng)性菌株吧。
小編幫你們列出的常見(jiàn) 41 種內(nèi)切酶的表格中可能收到甲基化影響的限制性內(nèi)切酶的種類，其中橙色標(biāo)注的表示該酶的識(shí)別序列與所對(duì)應(yīng)的甲基化的識(shí)別序列相同，當(dāng)存在該種類甲基化的時(shí)候，限制性內(nèi)切酶的功能將會(huì)被抑制；藍(lán)色標(biāo)注的表示該酶的識(shí)別序列與所對(duì)應(yīng)的甲基化的識(shí)別序列有部分重疊，需要具體看酶切位點(diǎn)序列相鄰部分是否存在特定的堿基，使得與該酶對(duì)應(yīng)的甲基化序列相同，如果不同，則不受到甲基化的影響；綠色標(biāo)注的表示該酶只有在真核生物中才會(huì)收到甲基化的影響。所以，大家以后遇到類似的問(wèn)題，多思考思考是否存在甲基化的影響呢！
等等！你們可能發(fā)現(xiàn)了，小編你是不是說(shuō)漏了一個(gè)。表中不是還有一個(gè)紅色標(biāo)注的嗎？那個(gè)又是怎樣一個(gè)情況呢？嗯！這都被你們發(fā)現(xiàn)啦。是的，這里面存在一個(gè)特殊的酶——DpnI，這個(gè)酶也是馬上小編要告訴大家的另一個(gè)秘密。我們看看怎么回事吧！
不用酶切，PCR 也可以幫你完成分子克隆：
1、反式 PCR我們都知道，在做分子克隆的時(shí)候，必須要用限制性內(nèi)切酶將環(huán)狀質(zhì)粒切割成為線性，才能夠連接我們的目的片段。那么，大家有沒(méi)有想過(guò)，在我們的酶切位點(diǎn)兩頭，以質(zhì)粒為模板設(shè)計(jì)引物，反向直接擴(kuò)增我們的質(zhì)粒呢？這樣的質(zhì)粒天生就是線性化的質(zhì)粒，而且無(wú)需進(jìn)行搖菌培養(yǎng)質(zhì)粒提取和酶切等復(fù)雜的操作。這就是我們所說(shuō)的反式 PCR。是不是很簡(jiǎn)單？對(duì)，就是這么簡(jiǎn)單到你懷疑人生。但有一個(gè)問(wèn)題來(lái)了，整個(gè)反應(yīng)體系中的模板即我們?cè)瓉?lái)的環(huán)狀質(zhì)粒，如果在進(jìn)行克隆連接的時(shí)候豈不是也被導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中表達(dá)，也就是說(shuō)我們挑菌的時(shí)候也是有概率會(huì)挑到這些空載載體的！如何解決？接著看就明白了。
2、DpnI 切割反式 PCR 中的環(huán)狀質(zhì)粒之前小編在甲基化中提到過(guò)，我們還有一個(gè)特殊的限制性內(nèi)切酶沒(méi)有提到，它就是 DpnI。這個(gè)酶之所以特殊，其原因在于它不同于其他的限制性內(nèi)切酶，它只有當(dāng)存在 GATC 序列被甲基化的時(shí)候才能夠發(fā)揮它的活性，進(jìn)行完全的切割，也就是說(shuō)它和其他受到甲基化影響的酶是相反的。甲基化只有在甲基化陽(yáng)性的原核或者真核生物中才能夠存在。所以，當(dāng)我們用 Dam+菌株提取的質(zhì)粒進(jìn)行反式 PCR 的時(shí)候，為了降低后期克隆實(shí)驗(yàn)的空載率，我們需要使用 DpnI 來(lái)消化我們?cè)瓉?lái)用于模板擴(kuò)增的環(huán)狀質(zhì)粒，由于質(zhì)粒上存在多個(gè) GATC 甲基化的序列，因此，DpnI 能夠?qū)⒃瓉?lái)環(huán)狀質(zhì)粒直接切割成多條片段，另外，PCR 擴(kuò)增的線性質(zhì)粒并沒(méi)有在原核生物體內(nèi)進(jìn)行過(guò)甲基化，因此線性質(zhì)粒的序列不會(huì)被 DpnI 識(shí)別切割，從而達(dá)到我們分離環(huán)狀質(zhì)粒和線性質(zhì)粒的需求。這里需要提醒下小伙伴們，如果你們的質(zhì)粒模板是從 Dam-菌株里面提取的，那么以上的方法就不再適用了！至于原因，大家可以想一想，小編就不在這里贅述了。
關(guān)于限制性內(nèi)切酶，目前已經(jīng)商業(yè)化的品種已經(jīng)兩百多種，作為目前世界排名靠前的內(nèi)切酶生產(chǎn)商，莫納生物對(duì)這類基礎(chǔ)工具酶已經(jīng)研究探索多年，為了打破國(guó)外四十多年的壟斷地位，繞過(guò)保護(hù)，莫納生物自主研發(fā)了全新的內(nèi)切酶生產(chǎn)工藝，目前在售的快速內(nèi)切酶已經(jīng)四十多種（持續(xù)增長(zhǎng)中），現(xiàn)階段已經(jīng)基本滿足常規(guī)的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)需求。
都 9102 年了，你還在用傳統(tǒng)的方法做克��？克隆虐我千百遍，我待克隆如初戀。做個(gè)克隆，至少需要兩天的時(shí)間，還要忙前忙后準(zhǔn)備一大堆需要的東西。麻不麻煩，累不累啊！有這個(gè)時(shí)間，我多看兩篇文獻(xiàn)，多編兩行 Python 代碼不好嗎？小編說(shuō)過(guò)，越基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)越是需要牢固掌握，但同樣越是基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)越是需要我們節(jié)省時(shí)間，提高效率。
無(wú)縫克隆在幾年前可能是個(gè)陌生的詞匯，但隨著國(guó)內(nèi)外各大品牌廠商的開(kāi)發(fā)與成熟，你敢說(shuō)你還沒(méi)聽(tīng)過(guò)這樣一個(gè)神奇的實(shí)驗(yàn)？莫納生物也有自主研發(fā)的無(wú)縫克隆
試劑盒喲，接下來(lái)小編就給大家科普一下。
1、什么是無(wú)縫克隆，它的原理是什么？無(wú)縫克隆又叫同源重組，它可以將單個(gè)至多個(gè)片段同時(shí)插入到一個(gè)載體中，而不需要進(jìn)行多次的酶切和純化。通常情況下，無(wú)縫克隆可以在 5-15 min內(nèi)完成多個(gè)片段的連接，其克隆陽(yáng)性率高達(dá) 98% 以上。但需要注意的是，我們?cè)跓o(wú)縫克隆前進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增的時(shí)候，載體與片段之間、片段與片段之間需有 15-20 堿基的一段同源序列，這是為什么呢？因?yàn)槲覀儫o(wú)縫克隆的試劑盒里面存在三種酶，分別是 T5 核酸外切酶、DNA 聚合酶、DNA 連接酶。其中 T5 核酸外切酶具有 5’-3’核酸外切酶的活性，能夠?qū)⑿蛄袕? 5’-3’開(kāi)始降解，此時(shí)暴露出載體以及片段的3’同源序列，經(jīng)過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)，DNA 聚合酶添加缺失堿基后由 DNA 連接酶將片段與載體進(jìn)行連接，從而達(dá)到載體重組的功能。因此，如果不添加同源序列，載體與片段、片段與片段之間將無(wú)法進(jìn)行連接。
2、無(wú)縫克隆引物設(shè)計(jì)大家現(xiàn)在對(duì)無(wú)縫克隆已經(jīng)有一個(gè)深入的了解了，那么我們來(lái)看看，在做無(wú)縫克隆之前，跑 PCR 的時(shí)候引物設(shè)計(jì)有哪些要求呢？
引物添加的順序 5’-3’：
同源序列+特異性引物（克隆后無(wú)需進(jìn)行酶切，適用于表達(dá)載體）
同源序列+保護(hù)堿基+酶切位點(diǎn)+特異性引物（克隆后還需要進(jìn)行酶切或者亞克�。�這里需要提醒大家注意一下，由于無(wú)縫克隆的引物在普通 PCR 的引物基礎(chǔ)上添加了額外的附加堿基（同源序列、保護(hù)堿基、酶切位點(diǎn)），Tm 值可能會(huì)較常規(guī)引物的高。但我們?cè)谧?PCR 的時(shí)候，、二次循環(huán)，幾乎只有特異性引物的序列與模板結(jié)合，此時(shí)應(yīng)該只計(jì)算特異性引物的 Tm 值，否則會(huì)出現(xiàn)退火溫度過(guò)高，PCR 擴(kuò)增不出條帶。但后面的循環(huán)，特異性引物和附加堿基均能夠和、二次擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行結(jié)合擴(kuò)增，并占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。此時(shí)引物 Tm 值應(yīng)該按照整條引物的 Tm 值計(jì)算。因此，在做無(wú)縫克隆前的 PCR 擴(kuò)增時(shí)，建議大家在第二個(gè)循環(huán)后提高退火溫度進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，更有利于產(chǎn)物的形成。
3、無(wú)縫克隆的連接時(shí)間的選擇雖然說(shuō)，無(wú)縫克隆帶給我們很多的便利，但小編需要告訴大家需要注意一點(diǎn)兒的是，無(wú)縫克隆連接的片段數(shù)量有限，一次連接超過(guò) 6 個(gè)或者載體+片段超過(guò) 13 Kb 后，其連接時(shí)間會(huì)增加且陽(yáng)性率會(huì)降低，甚至出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)失敗的情況。因此，在做無(wú)縫克隆實(shí)驗(yàn)的時(shí)候需要多多計(jì)算一下。
結(jié)束語(yǔ)：看了這么多，是不是發(fā)現(xiàn)，原來(lái)一個(gè)小小的分子克隆實(shí)驗(yàn)還有這么多的學(xué)問(wèn)？還有好多自己不知道的秘密。其實(shí)，大家做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，不要僅僅停留在它的一個(gè)表面，認(rèn)為它只是一個(gè)再基礎(chǔ)不過(guò)的東西，深入探索一下會(huì)發(fā)現(xiàn)里面其實(shí)還有很多有趣的事情和講究，這里面只是告訴了大家一些比較實(shí)用的方法和技巧，更深層次的東西大家下來(lái)可以慢慢摸索。祝大家實(shí)驗(yàn)順利！
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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