人elisa試劑盒如何進(jìn)行洗滌，它的顯色原理是什么。今天上海遠(yuǎn)慕為您一一說明。
洗滌�。�
洗滌是ELISA不同于均相免疫學(xué)檢測技術(shù)的一大特征，洗滌在整個(gè)ELISA反應(yīng)過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，卻非常關(guān)鍵。其目的是去除反應(yīng)體系中與反應(yīng)無關(guān)的成分，包括未結(jié)合的酶結(jié)合物以及反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗滌液通常為含有一定濃度Tween 20 的緩沖液，Tween 20 是一種非離子去垢劑，既含親水基團(tuán)，又含疏水基團(tuán)，在洗滌中的作用機(jī)制是借助其疏水基團(tuán)與經(jīng)疏水性相互作用被動吸附于聚苯乙烯固相上蛋白分子的疏水基團(tuán)形成疏水鍵，從而削弱蛋白分子與固相的吸附。同時(shí)在其親水基團(tuán)與液相中水分子的結(jié)合作用下，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子脫離固相而進(jìn)入液相，*終被洗脫。必須注意非離子去垢劑的使用濃度，*常用的洗滌液是含0.05 %Tween20，pH為中性的磷酸鹽緩沖液，如果洗滌液中的Tween20 超過0.2% ，可使包被于固相上的抗原抗體解吸附而影響實(shí)驗(yàn)的測定下限。洗滌可采用洗板機(jī)或手工洗滌兩種方式，手工洗板則分為浸泡式和流水沖洗式洗滌。無論洗板方式如何，在向板內(nèi)注液時(shí)應(yīng)當(dāng)避免氣泡殘留孔內(nèi)，否則會因洗滌液難以進(jìn)入孔中而影響洗滌效果。在采用洗板機(jī)洗板時(shí)，要保證洗板機(jī)上的每個(gè)吸液針都能一致地插入板孔底部將洗液完全吸凈，要求洗板后殘液小于2 μL，即人工扣板墊紙不濕，浸泡時(shí)間超過45 秒。
顯色 ：
大多數(shù)情況下ELISA商品多選用HRP 和堿性磷酸酶（ALP）。HRP可催化的底物為過氧化氫，參加反應(yīng)的顯色供氫體有鄰苯二胺（OPD）、鄰聯(lián)甲苯胺（OT）及四甲基聯(lián)苯胺（TMB）等。其中OPD 難溶于水，見光易變質(zhì)，使用前配制，反應(yīng)過程須避光且OPD有一定毒性。TMB 的反應(yīng)產(chǎn)物為藍(lán)色，目視對比鮮明，其性質(zhì)穩(wěn)定，對人體無毒。若選用各類酸性終止液，則會使藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。TMB作底物時(shí)的產(chǎn)物檢測波長為450 nm ，ALP 作為標(biāo)記物，其底物一般采用對硝基苯磷酸酯（pNPP），產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，吸收波長是405 nm。為了保證結(jié)果的穩(wěn)定性，必須要嚴(yán)格按照試劑盒說明書中規(guī)定的溫度和時(shí)間操作，不可隨意改變溫度和時(shí)間。
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