質(zhì)粒抽提過程中有很多步驟會(huì)影響/后的產(chǎn)量和質(zhì)量，那么如何評(píng)估質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量呢？
目使用分光光度法定量質(zhì)粒DNA和通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)粒DNA產(chǎn)率和質(zhì)量的分析是兩種常用的方法。
溶液中的核酸濃度可通過260 nm的吸光度方便地進(jìn)行計(jì)算。A260的數(shù)值處于0.1至1.0之間時(shí)測(cè)量結(jié)果具有良好的重復(fù)性，但當(dāng)A260數(shù)值小于0.1或大于1.0的時(shí)候，結(jié)果的可重復(fù)性將顯著下降。而且，3.0以上的讀值是無(wú)法使用的，它可能會(huì)潛在導(dǎo)致對(duì)DNA質(zhì)量的低估。因此，為了獲得可靠的DNA分光光度定量結(jié)果，A260的讀值需要處于0.1至1.0之間。當(dāng)檢測(cè)小量DNA時(shí)，使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行的定量分析可能更為可靠。
造成較低的產(chǎn)率和質(zhì)量的可能因素有很多。為了確定存在問題的環(huán)節(jié)，可于每一純化步驟都保留一小部分樣品，并通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。
制備樣本
如各個(gè)實(shí)驗(yàn)方案和下列表格中所示，從澄清裂解液（樣本1）、流出液（樣本2）、QC洗滌緩沖液的混合組分（樣本3）和QF/QN緩沖液洗脫產(chǎn)物（樣本4）中各取出部分樣品。使用1倍體積的異丙醇沉淀核酸，并使用70%的乙醇洗滌該沉淀，充分蒸干后重懸于10 µl pH8.0的TE緩沖液中。
樣本實(shí)驗(yàn)方案步驟 MidiMaxiMegaGiga（低拷貝數(shù)質(zhì)粒/科斯質(zhì)粒） QIAGEN-tip 100（低拷貝數(shù)質(zhì)粒/科斯質(zhì)粒）QIAGEN-tip 5001240 µl120 µl120 µl75 µl600 µl750 µl2240 µl120 µl120 µl75 µl50 µl24 µl3400 µl240 µl160 µl120 µl200 µl120 µl4100 µl60 µl22 µl20 µl50 µl30 µl(制備產(chǎn)物占樣本量的百分比)2%0.40%0.08%0.02%1%0.20%
瓊脂糖凝膠分析
在1%的瓊脂糖凝膠中，對(duì)于各個(gè)質(zhì)粒純化步驟中的對(duì)應(yīng)樣品各加入2 µl進(jìn)行電泳。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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