P物質(zhì)（SP）檢測
試劑盒 檢測范圍 12.35-1000pg/mL 靈敏度 4.84pg/mL
樣本類型 Serum, plasma, tissue homogenates, cell lysates, cell culture supernates ａnd otherbiological fluids.
實驗時長 2.5h 實驗方法 競爭抑制法
P物質(zhì)（SP）檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附試驗法）
適用生物：人
使用說明書
僅供體外研究使用，不用于臨床診斷！
P物質(zhì)（SP）檢測試劑盒[預(yù)期應(yīng)用]
本試劑盒運用競爭抑制ELISA 法定量測定人血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、
細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物
液體中SP 含量。
[試劑盒內(nèi)容]
試劑名稱數(shù)量試劑名稱數(shù)量
96孔板（預(yù)包被） 1 96孔板覆膜4
標(biāo)準(zhǔn)品2 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1×20mL
檢測
溶液A 1×120μL 檢測稀釋液A 1×12mL
檢測溶液B 1×120μL 檢測稀釋液B 1×12mL
TMB底物1×9mL 終止液1×6mL
濃洗滌液（30×） 1×20mL 使用說明書1
[需自備的設(shè)備及試劑]
1、450±10nm 濾光片的酶標(biāo)儀（建議
儀器使用前提前預(yù)熱）
2、單道或多道微量加液器及吸頭
3、稀釋樣品的EP 管
4、蒸餾水或去離子水
5、吸水紙
6、盛放洗液的容器
[試劑盒的儲存及有效期]
1、未開封的試劑盒：所有試劑均按試劑瓶標(biāo)簽上所示保存。請注意，收到試劑盒后請盡快將標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A、檢測溶液B 以及96 孔板保存于-20oC。
2、使用后的試劑盒：剩余試劑仍需按照試劑瓶標(biāo)簽所示的溫度保存，開封后的酶標(biāo)板要加干燥劑后密封保存于-20oC，避免潮濕。
注意：
試劑盒內(nèi)酶標(biāo)條可拆卸，按實驗需求可分多次使用；使用后的剩余試劑盒建議在首次實驗后1 個月內(nèi)使用完畢。
產(chǎn)品過期時間以盒子上的標(biāo)簽為準(zhǔn)，保質(zhì)期內(nèi)所有組分都確保是穩(wěn)定的。
[標(biāo)本的采集與保存]
1、血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2 小時或4oC 過夜，然后1000×g 離心20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20oC 或-80oC 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2、血漿：用EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30 分鐘內(nèi)于2-8oC 1000×g 離心15 分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20oC 或-80oC 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3、組織勻漿：
1） 取適量組織塊，于預(yù)冷PBS（0.01mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，稱重后備用（組織塊較大需先剪碎后再勻漿）；
2） 可同時選用多種勻漿方法達(dá)到較好的破碎效果：首先將組織塊移入玻璃勻漿器，加入5-10mL 預(yù)冷PBS 進(jìn)行充分研磨，該過程需在冰上進(jìn)行（有條件實驗室可選用機器勻漿）；得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復(fù)凍融進(jìn)一步處理（超聲破碎過程中注意冰浴降溫；反復(fù)凍融法可重復(fù)2 次）。
3） 將制備好的勻漿液于5000×g 離心5 分鐘，留取上清即可檢測。
4、細(xì)胞裂解液：
1）貼壁細(xì)胞需要先用胰酶消化，離心收集細(xì)胞（懸浮細(xì)胞可直接離心收集）；
2）將收集到的細(xì)胞用冷PBS 洗3 次；
3）物理方法裂解細(xì)胞（可先超聲破碎細(xì)胞，再反復(fù)凍融）：
i 超聲破碎：取適量PBS 重懸細(xì)胞，用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂。
ii 反復(fù)凍融：將待破碎的細(xì)胞在-20oC 以下冰凍，室溫融解，反復(fù)3 次，使細(xì)胞溶脹破碎。
4）將標(biāo)本于2-8oC 1500×g 離心10 分鐘，收集上清備用。
5、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它生物標(biāo)本：請1000×g 離心20 分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20oC 或-80oC 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注意：
1、以上標(biāo)本均需密封保存，4oC 保存應(yīng)小于1 周，-20oC 不應(yīng)超過1 個月，-80oC 不應(yīng)超過2 個月。
2、標(biāo)本溶血會影響*后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。
3、標(biāo)本使用前應(yīng)緩慢均衡至室溫，不應(yīng)加熱使之融解。
[試劑準(zhǔn)備]
1、使用前將所有的試劑和標(biāo)本緩慢均衡至室溫（18-25oC），試劑不能直接在37oC 溶解。
2、標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：每瓶標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.0mL，蓋好后室溫靜置大約10 分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動
以助溶解，其濃度為1,000pg/mL。準(zhǔn)備5 個稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的EP 管，每個EP 管中加入600μL 的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，
依次三倍稀釋成1,000pg/mL, 333.33pg/mL, 111.11pg/mL, 37.04pg/mL, 12.35pg/mL，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（0pg/mL）直接作為空白孔。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
Tube 1 2 3 4 5 6
pg/mL 1,000 333.33 111.11 37.04 12.35 0
3、檢測溶液A 及檢測溶液B：Detection A 及Detection B 在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。臨用前分別以檢測稀釋液A 或B1:100 稀釋（如：10μL 檢測溶液A/990μL 檢測稀釋液A），充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（50μL/孔），實際配制時應(yīng)多配制
0.1-0.2mL。
4、濃洗滌液：用580mL 蒸餾水或去離子水將20mL 濃洗滌液稀釋至600mL，進(jìn)行30 倍稀釋。
5、底物溶液：請用滅菌的移液器吸頭吸取所需體積的TMB 至另一干凈容器中使用，容器中剩余的底物應(yīng)予丟棄，不要倒回TMB 瓶中。
注意：
1、標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋不能直接在板中進(jìn)行。
2、標(biāo)準(zhǔn)品請于臨用前15 分鐘內(nèi)配制。該標(biāo)準(zhǔn)品只能使用一次。
3、標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A 工作液、檢測溶液B 工作液請使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆�；靹驎r要輕輕充分混勻，避免起泡。為保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確請使用微量吸管，并校準(zhǔn)微量加液器。請依據(jù)所需的量精確配制，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A 時，一次不要小于10μL），以避免造成濃度誤差。
4、請勿重復(fù)使用已經(jīng)稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A 工作液和檢測溶液B 工作液。
5、濃洗滌液中如有結(jié)晶析出，請先溫育至室溫，輕輕混勻，至到結(jié)晶完全溶解再進(jìn)行配制。
6、試劑盒中部分試劑為儲存液，客戶需配置成工作液后使用，在配置過程中如因純凈水質(zhì)量差或水質(zhì)污染，以及實驗中所用耗材潔凈度差，可能造成實驗結(jié)果不準(zhǔn)確，甚至完全錯誤，請使用雙蒸水。
[標(biāo)本處理]
1、本公司只對試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本。
2、實驗前應(yīng)預(yù)測標(biāo)本含量，如果標(biāo)本濃度過高，應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行稀釋，使稀釋后的標(biāo)本符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。標(biāo)本使用0.01mol/L 的PBS 稀釋（PH=7.0-7.2）。
3、若所檢樣本不包含在說明書所列樣本之中，建議進(jìn)行預(yù)實驗驗證其有效性，并注意留存樣本。
4、使用化學(xué)裂解液制備的組織勻漿或細(xì)胞提取液可能會由于某些化學(xué)物質(zhì)的引入導(dǎo)致ELISA 實驗結(jié)果偏差。
5、若樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清，因該類樣本干擾因素較多，如：細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量、采樣時間等，所以可能存在檢測不出的情況。
6、某些天然
蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因為與本產(chǎn)品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測出。
7、建議使用新鮮樣本，保存時間過長可能會存在蛋白降解或變性導(dǎo)致實驗結(jié)果偏差。
[操作步驟]
1、加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔、空白孔。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔5 孔，依次加入50μL 不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（見試劑準(zhǔn)備2）。空白孔加50μL（見試劑準(zhǔn)備第二步*后一管），余孔加待測樣品50μL，然后立即每孔加檢測溶液A工作液50μL，輕輕振動，混勻，注意不要有氣泡，酶標(biāo)板加上覆膜，37oC 溫育1 小時。
2、棄去孔內(nèi)液體，每孔用350μL 的洗滌液洗滌，浸泡1-2 分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干），重復(fù)洗板3 次。*后一次洗滌后，要把孔內(nèi)的洗滌液完全甩干。自動洗板機亦可。
3、每孔加檢測溶液B 工作液（臨用前配制）100μL，加上覆膜，37oC 溫育30 分鐘。
4、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次，方法同步驟2。
5、每孔加底物溶液90μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37oC 避光顯色（反應(yīng)時間控制在15-25 分鐘，不要超過30 分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的后面3 孔有明顯的梯度藍(lán)色，前3 孔梯度不明顯時，即可終止）。
6、每孔加終止溶液50μL，終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請輕輕晃動酶標(biāo)板以使溶液混合均勻。
7、在確保酶標(biāo)板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標(biāo)儀在450nm 波長測量各孔的光密度（O.D.值）。
注意：
1、試劑準(zhǔn)備：準(zhǔn)備一次實驗所需要的酶標(biāo)條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說明書要求保存，以備下次使用。
2、加樣：實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。加樣時注意不要有氣泡，將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。加樣或加試劑時，個孔與*后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。因此，一次加樣時間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）控制在10 分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實驗。
3、溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時請將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)，洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)，同時應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時間和溫度。
4、洗滌：充分的洗滌非常重要，在每次洗滌過程中，都要將洗滌液完全甩干。洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響*后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
5、反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10 分鐘觀察一次），如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。
6、底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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