MTT分析法
原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物(formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。二甲亞砜(DMSO)能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。
實(shí)驗(yàn)材料：細(xì)胞樣品試劑、試劑盒：PBSDMSO胰蛋白酶甘氨酸緩沖液儀器、耗材：加樣器96孔培養(yǎng)板酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀培養(yǎng)板
具體操作：普通MTT法1、接種細(xì)胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1000-10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200ul。2、培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天(可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間)。3、呈色：培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ulDMSO，脫色搖床振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解。4、比色：選擇490nm(570nm)波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
藥物MTT法貼壁細(xì)胞：1、收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度1000-10000孔，(邊緣孔用無(wú)菌PBS填充)。2、5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞貼壁，加入濃度梯度的藥物,原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，一般是前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般5-7個(gè)梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)5個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)況。3、5%CO2，37℃孵育24-72小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。4、每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。5、終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。6、每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm(570nm)處測(cè)量各孔的吸光值。7、同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔即空白組(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)。
懸浮細(xì)胞：1、收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a(bǔ)足的1640(無(wú)血清)培養(yǎng)基40ul；②加ActinomycinD(有毒性)10ul用培養(yǎng)液稀釋(儲(chǔ)存液100mg/ml，需預(yù)試尋找*稀釋度，1:10-1:20)；③需檢測(cè)物10ul；④細(xì)胞懸液50ul(即5×104cell/孔)，共100ul加入到96孔板(邊緣孔用無(wú)菌水填充)。每板設(shè)對(duì)照(加100ml1640)。2、置37℃，5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。3、每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。(懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4h后可跳過(guò)步驟4)，直接酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm(630nm校準(zhǔn))測(cè)量各孔的吸光值)離心(1000轉(zhuǎn)x10min)，小心吸掉上清，每孔加入100ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm(630nm校準(zhǔn))測(cè)量各孔的吸光值。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定3復(fù)孔。
注意事項(xiàng)：1、選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。
2、避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。
3、設(shè)空白對(duì)照：與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照。其他試驗(yàn)步驟保持一致，*后比色以空白調(diào)零。
4、MTT實(shí)驗(yàn)吸光度*后要在0-0.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線關(guān)系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的時(shí)候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計(jì)算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖，然后得到50％抑制率時(shí)候的藥品濃度，就是IC50。要點(diǎn)：藥品2倍稀釋，多做梯度，做點(diǎn)線圖即可！
5、吹打時(shí)懸液總量不能太多，達(dá)到吸管吸液量的3-4倍，可能比較容易混勻。10ml的離心管里面裝3-4ml的懸液：懸液太少容易吹起很多氣泡，懸液太多又不容易吹成單細(xì)胞懸液。
6、吸管的吸液量在1ml左右：吸液量過(guò)多，一下吸起很多液體，管中所剩就很少，這樣吹打容易起泡，吸液量過(guò)少，吹打的力度就不夠，吹打就會(huì)不均勻。如果是吸液量1ml多的吸管，總液量在5ml左右為益。
7、吸的時(shí)候要在懸液底部，然后提起來(lái)一點(diǎn)，但是吹下去的時(shí)候不要離開液面，否則容易吹打出氣泡。
8、吹打次數(shù)100左右，就可以吹打均勻了。
9、向每孔中用槍頭加入細(xì)胞時(shí)不要太快，否則會(huì)使細(xì)胞聚積在底部。
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