酶聯(lián)免疫吸附試驗的雙位點(diǎn)一步法
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雙位點(diǎn)一步法的應(yīng)用
適用于雙抗體夾心法的Elisa試劑盒，有些也可用雙位點(diǎn)一步法檢測。如HBsAg同樣可用此法進(jìn)行檢測，其原理為：將純化的抗HBs吸附于固相載體表面，加入待檢血清(或血漿)，同時加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的另一個抗HBs(酶結(jié)合物)，如血清或血漿中含有HBsAg，則通過溫育形成固相McAb-HBsAg-酶標(biāo)McAb復(fù)合物，加入底物，通過顯色反應(yīng)進(jìn)行測定。若血清或血漿中不含HBsAg，通過洗滌除去未結(jié)合物，加底物后就不顯色。由于應(yīng)用McAb，雙位點(diǎn)一步法具有很高特異性，一步法省時、簡便。
在雙抗體夾心法測定抗原時，如應(yīng)用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測定時可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步。這種雙位點(diǎn)一步法不但簡化了操作，縮短了反應(yīng)時間，如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)（hookeffect），類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測抗原濃度相當(dāng)高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
雙位點(diǎn)一步法的操作步驟
1、將1個McAb與固相載體連接，形成固相McAb。洗滌除去未結(jié)合物。
2、同時加入待檢標(biāo)本和酶標(biāo)McAb，溫育，是待檢抗原和固相McAb及酶標(biāo)McAb反應(yīng)形成雙抗體夾心復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合物。
3、加底物顯色。
雙位點(diǎn)一步法注意事項
當(dāng)待檢抗原濃度過高時，大量過�？乖謩e飽和固相McAb和酶標(biāo)McAb而抑制夾心復(fù)合物的形成，這種現(xiàn)象稱為鉤狀效應(yīng)(hookeffect)，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果�？蓪⒋龣z標(biāo)本稀釋后再做或提高抗體試劑的親和力、濃度、純度定以消除鉤狀效應(yīng)。
Elisa試劑盒雙位點(diǎn)一步法應(yīng)用識別抗原不同位點(diǎn)2個單克隆抗體(McAb)作雙抗體夾心法測定。包被一個McAb后，同時加入待檢抗原和另一個McAb酶標(biāo)物，待檢抗原上的2個抗原決定簇同時與固相McAb和酶標(biāo)McAb結(jié)合，形成固相McAb-待檢抗原-酶標(biāo)McAb復(fù)合物，加底物通過顯色反應(yīng)進(jìn)行測定。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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