遠(yuǎn)慕生物分享---測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞中污染的支原體_技術(shù)文章

技術(shù)文獻(xiàn)

遠(yuǎn)慕生物分享---測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞中污染的支原體
閱讀次數(shù)：693 發(fā)布時(shí)間：2016/9/26 11:17:10

分享到：

    遠(yuǎn)慕生物分享－－-測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞中污染的支原體

    PCR法
    原理該法是通過PCR技術(shù)將支原體16srRNA基因特異性擴(kuò)增，來檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞中污染的支原體。PCR引物選自16srRNA基因上的支原體特異片段，此片段與其他細(xì)菌的序列無(wú)交叉性雜交反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)溴乙啶（EB）染色后在紫外透射儀上進(jìn)行檢測(cè)。

    u16srDNA引物用水稀釋至40umol/L。
    （1）.正向引物：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3’
    （2）.反向引物：5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3’
    2）PCR擴(kuò)增
    （1）在冰浴中對(duì)各樣品制備PCR重要混合物，對(duì)每個(gè)樣品均加入：
    10XPCR緩沖液5.0ml
    25mmol/LdNTPs混合物0.4ul
    40umol/L16srDNA引物每種引物1.0ul
    40umol/LpBR322DNA引物每種2.0ul
    pBR322DNA1pg/ml2.0ul
    DNA聚合酶（5U/ml）0.2ul
    三蒸水35.4ul
    總量45ul

    （2）用無(wú)菌去離子水稀釋樣品為1:10，1:100。
    （3）于每個(gè)eppendorf管中加45ulPCR擴(kuò)增混合物，每管中分別加入樣品原液及1:10，1:100稀釋液各5ul，操作均在冰浴中進(jìn)行。
    （4）在每個(gè)eppendorf管中輕輕加入50ul無(wú)菌礦物油，覆蓋在液面上。如DNA擴(kuò)增儀帶有有制式熱蓋，此步驟可省略。
    （5）將各管放入DNA擴(kuò)增儀的孔槽內(nèi)，并執(zhí)行以下循環(huán)指令：
    ①950C10min一個(gè)循環(huán)
    ②950C，30S→580C1min→720C1min,共30個(gè)循環(huán)。
    ③*后720C10min延長(zhǎng)循環(huán)。

    上海遠(yuǎn)慕生物公司主要供應(yīng)elisa試劑盒、生物試劑、血清、標(biāo)準(zhǔn)品....并代理銷售Spectrum、Amresco、Sigma、Pharmacia、Omega、R&D、RB、ATCC、HYCLONE、Gibco、BRL、Abcam等二十多家國(guó)外知名品牌，本司長(zhǎng)期以高質(zhì)量，高品質(zhì)產(chǎn)品服務(wù)各大高校及科研院所。公司與國(guó)內(nèi)眾多科研單位建立長(zhǎng)久的合作關(guān)系，并將一如既往為廣大生物科研工作者提供*優(yōu)質(zhì)、*專業(yè)的服務(wù)。咨詢電話：021-58993001 QQ：953483277

原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司