在兩種或兩種以上熒光素之間，如果熒光發(fā)射峰很近，那么熒光光譜彼此會(huì)有部分重疊，檢測(cè)時(shí)可能出現(xiàn)一種熒光素的信號(hào)擴(kuò)散到另一熒光通道的情況。這種現(xiàn)象稱(chēng)為串色或熒光光譜交叉(crosstalk)。避免或排除光譜交叉干擾的方法通常有以下幾種：
1. 使用幾種熒光素時(shí)，盡量選擇相互之間無(wú)光譜交叉的熒光素。
2. 降低標(biāo)記熒光強(qiáng)度：樣品的一種或幾種熒光強(qiáng)度太高，有時(shí)會(huì)導(dǎo)致光譜交叉出現(xiàn)。采用降低標(biāo)記物濃度、縮短標(biāo)記時(shí)間及調(diào)整熒光素介質(zhì)等方法可降低樣品熒光強(qiáng)度。
3. 采用序列掃描方法：主要是指用不同波長(zhǎng)激光輪流照射樣品，同時(shí)在相應(yīng)的熒光檢測(cè)通道輪流采集，并顯示每種熒光的共聚焦圖像。對(duì)于雙重?zé)晒馊旧珮悠菲渚唧w操作過(guò)程是：先只用一種激光激發(fā)相應(yīng)的第1種熒光物質(zhì)，在第1通道顯示其熒光圖像；再用另一種激光激發(fā)另一種熒光物質(zhì)，在第二通道顯示其熒光圖像。相應(yīng)的順序掃描軟件能夠?qū)赏ǖ赖牟煌瑹晒鈭D像同時(shí)分通道顯示并疊加合成，展示出兩熒光間空間定位關(guān)系。依此類(lèi)推，用順序掃描方法還可以采集三重或更多重?zé)晒鈽悠返膱D像。
4. 修改光譜檢測(cè)儀器的檢測(cè)條件：在圖像上出現(xiàn)比較弱的熒光交叉信號(hào)時(shí)，可通過(guò)改變儀器的檢測(cè)條件來(lái)克服。常用的措施有：
①降低干擾熒光的激發(fā)光強(qiáng)度以降低其發(fā)射熒光強(qiáng)度；
②減小被干擾通道的檢測(cè)靈敏度；
③改變激發(fā)光波長(zhǎng)和檢測(cè)波長(zhǎng)范圍等。
例如在熒光通道2的圖像上看到來(lái)自通道1的較弱的熒光交叉信號(hào)，這時(shí)，在保/證采集到各通道清晰圖像的情況下，降低通道1的激發(fā)強(qiáng)度，減小通道2的光電倍增管效能以降低其采集的靈敏度，小范圍內(nèi)改變各通道的檢測(cè)波長(zhǎng)，可以消除來(lái)自通道1的熒光 交叉信號(hào)。
5. 熒光光譜鑒別法：通常情況下，不同熒光物質(zhì)的熒光光譜不會(huì)完/全重疊，利用不同熒光光譜之間的差異，可以將來(lái)自于兩種熒光物質(zhì)的熒光信號(hào)鑒別開(kāi)來(lái)，得到各自的熒光圖像。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
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